SV40ST使良性永生化前列腺上皮細(xì)胞獲得TRAIL敏感表型的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：良性永生化前列腺上皮細(xì)胞LH/LE對(duì)TRAIL不同敏感性及其機(jī)制研究
　　 目的：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）可選擇性誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)絕大多數(shù)正常細(xì)胞無毒性作用，這一特性使TRAIL在抗腫瘤治療中具有很好的應(yīng)用前景。本研究是為了明確良性永生化前列腺上皮細(xì)胞LH/LE對(duì)TRAIL的不同敏

2、感性及其機(jī)制。
　　 方法：正常前列腺上皮細(xì)胞通過導(dǎo)入猿猴空泡病毒40（SV40）大T抗原和端粒酶末端轉(zhuǎn)移酶催化亞單位（hTERT），使其永生化，得到LH細(xì)胞；在這基礎(chǔ)上又導(dǎo)入SV40小T抗原片段，得到LE細(xì)胞。TRAIL作用于這兩種細(xì)胞后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。Western blot檢測(cè)PP2A和c-Fos的蛋白表達(dá)。TRAIL處理LH和LE細(xì)胞后檢測(cè)PP2A酶活性。S

3、PSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：LH細(xì)胞對(duì)TRAIL耐受，LE細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感。TRAIL作用后大約45％的LE細(xì)胞發(fā)生凋亡，而TRAIL作用后的LH細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例很低。Western blot結(jié)果顯示，PP2A蛋白表達(dá)量在LH細(xì)胞與LE細(xì)胞間未見明顯差異，而PP2A的酶活性在LH細(xì)胞中明顯高于LE；c-Fos蛋白表達(dá)在LE細(xì)胞中明顯高于LH細(xì)胞。
　　 結(jié)論：SV40ST賦予了良性永生化前列腺

4、上皮細(xì)胞LE細(xì)胞TRAIL敏感性表型。
　　 第二部分：奧克代酸誘導(dǎo)TRAIL耐受的良性永生化前列腺上皮細(xì)胞LH細(xì)胞獲得TRAIL敏感表型的研究
　　 目的：研究奧克代酸（Okadaic acid，OA）誘導(dǎo)TRAIL耐受的LH細(xì)胞獲得TRAIL敏感性及其機(jī)制。
　　 方法：蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制劑OA處理TRAIL耐受的良性永生化前列腺上皮細(xì)胞LH細(xì)胞后，TRAIL作用于處理組和對(duì)照組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞

5、活力，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。Western blot檢測(cè)PP2A和c-Fos的蛋白表達(dá)。酶活性試劑盒檢測(cè)PP2A酶活性。用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：顯示經(jīng)OA誘導(dǎo)后的LH細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感，細(xì)胞形態(tài)學(xué)可見大量的細(xì)胞發(fā)生凋亡，流式細(xì)胞檢測(cè)顯示經(jīng)OA誘導(dǎo)TRAIL作用后的LH細(xì)胞有大約32％的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而未經(jīng)OA誘導(dǎo)TRAIL作用后的LH細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞的比例很低。Western b

6、lot結(jié)果顯示，經(jīng)OA誘導(dǎo)后LH細(xì)胞中PP2A蛋白表達(dá)量明顯減少，PP2A酶活性明顯下降，而c-Fos蛋白表達(dá)量經(jīng)OA誘導(dǎo)后明顯增多。
　　 結(jié)論：OA誘導(dǎo)TRAIL耐受的LH細(xì)胞獲得TRAIL敏感表型。
　　 第三部分：A-Fos逆轉(zhuǎn)奧克代酸誘導(dǎo)TRAIL耐受的LH細(xì)胞向TRAIL敏感轉(zhuǎn)化的研究
　　 目的：明確c-Fos在良性永生化前列腺上皮細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性中的作用及其機(jī)制。
　　 方法：A-F

7、os質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LH細(xì)胞，奧克代酸（Okadaic acid，OA）處理后，TRAIL作用于各實(shí)驗(yàn)組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡狀態(tài)。Western blot檢測(cè)PP2A和c-Fos的蛋白表達(dá)。用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力顯示，經(jīng)OA誘導(dǎo)后的LH細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感，轉(zhuǎn)染A-Fos質(zhì)粒的LH細(xì)胞雖然經(jīng)OA誘導(dǎo)但對(duì)TRAIL敏感性下降；流式細(xì)胞術(shù)顯示：未經(jīng)OA誘導(dǎo)

8、TRAIL作用后的LH細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比例很低，經(jīng)OA誘導(dǎo)TRAIL作用后的LH細(xì)胞后有大約51％的細(xì)胞發(fā)生凋亡；而經(jīng)OA誘導(dǎo)TRAIL作用后，轉(zhuǎn)染A-Fos質(zhì)粒的LH細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率低于未轉(zhuǎn)染A-Fos質(zhì)粒的LH細(xì)胞；Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)OA誘導(dǎo)后未轉(zhuǎn)染組和A-Fos轉(zhuǎn)染組中PP2A蛋白表達(dá)量明顯減少，而c-Fos蛋白表達(dá)量增多；且A-Fos轉(zhuǎn)染組中c-Fos蛋白表達(dá)量低于未轉(zhuǎn)染組。
　　 結(jié)論：OA誘導(dǎo)TRA