RFFIT檢測體系的改進(jìn)和效果評估.pdf

1、目的：1.對快速熒光灶抑制試驗(yàn)（rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT）檢測體系進(jìn)行本土化改進(jìn)，以適應(yīng)國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室條件和檢測需求；2.對改進(jìn)后的RFFIT 體系進(jìn)行效果評估；3. 將本室已經(jīng)應(yīng)用成熟的RFFIT 體系與狂犬病疫苗抗原檢測方法進(jìn)行融合，形成改良抗體結(jié)合試驗(yàn)（modified antibody binding test, M-ABT）。
　　 方法：1. 將BSR（

2、BHK-21小克?。HK-21（金黃地鼠腎細(xì)胞）、MNA（小鼠成神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞）三種細(xì)胞以及CVS-11、CTN-181兩株狂犬病病毒分別引入RFFIT 檢測體系，以不同組合方式檢測10份標(biāo)本，初步鑒定檢測結(jié)果的一致性；繼而檢測106 份人血清樣品，系統(tǒng)比較不同組合方式下RFFIT 檢測結(jié)果的差異。2.對1011份人血清樣品進(jìn)行RFFIT 檢測，評估經(jīng)過本土化改進(jìn)的RFFIT 檢測體系的檢測效能。3. 利用自行制備的Alexa 48

3、8 標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體對200份標(biāo)本進(jìn)行RFFIT 檢測，評估自主制備的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體進(jìn)行RFFIT 檢測的效果。4. 將RFFIT與抗體結(jié)合試驗(yàn)（antibody binding test, ABT）方案融合，在疫苗樣品稀釋、剩余中和抗體檢測、結(jié)果計(jì)算方面進(jìn)行改進(jìn)，形成改良抗體結(jié)合試驗(yàn)（M-ABT）。應(yīng)用M-ABT對10種滅活狂犬病疫苗在不同庫存時(shí)間的疫苗效力進(jìn)行檢測，觀察疫苗效力隨時(shí)間改變的情況。

4、　　 結(jié)果：1.細(xì)胞培養(yǎng)：BSR、BHK-21、MNA細(xì)胞生長狀況良好，建立了這3種細(xì)胞的細(xì)胞種子庫；2. 病毒培養(yǎng)：狂犬病病毒CVS-11和CTN-181株對BSR、BHK-21、MNA細(xì)胞適應(yīng)良好，各代次病毒滴度均高于106 FFU/ml，符合RFFIT 檢測體系對毒種的要求；3. 改變細(xì)胞系和毒種后RFFIT 檢測體系的檢測效能評估：10份小批量樣本檢測：分別引進(jìn)BHK-21和MNA細(xì)胞系以及CTN-181病毒株后，RFFIT

5、檢測結(jié)果與采用BSR和CVS-11組合進(jìn)行檢測所得結(jié)果間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均大于0.05；106 份大批量樣本的檢測結(jié)果也表明引入新的細(xì)胞系和毒株后RFFIT檢測體系與國際標(biāo)準(zhǔn)體系檢測結(jié)果間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且有很好的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）大于0.75。4. 改進(jìn)RFFIT 檢測體系應(yīng)用效果評估：⑴不同細(xì)胞系對RFFIT 檢測結(jié)果的影響：以CVS-11病毒株作為攻擊病毒，分別應(yīng)用BSR、BHK-21、MNA細(xì)胞系，對1011份人

6、血清樣品進(jìn)行RFFIT 檢測，不同檢測體系的陽性檢出率差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均大于0.05；不同檢測體系下陽性標(biāo)本檢測結(jié)果幾何均值（geometric mean titer, GMT）差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均大于0.05；不同檢測體系下檢測結(jié)果相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)r大于0.75；⑵不同操作環(huán)境對RFFIT 檢測結(jié)果的影響：在不同地理位置、操作環(huán)境迥異的實(shí)驗(yàn)室，由相同的操作人員應(yīng)用CVS-11毒株和BHK-21細(xì)胞系對上述陽性人血清標(biāo)本再

7、次進(jìn)行RFFIT 檢測，檢測結(jié)果與原實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行檢測所得結(jié)果間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值均大于0.05。5. 采用自主制備Alexa 488 標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體后RFFIT 檢測體系檢測效能評估：對200份血清樣品的檢測顯示采用自主制備Alexa 488 標(biāo)記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體與進(jìn)口單抗Millipore DFA 5100檢測結(jié)果差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)系數(shù)r=0.980。6. M-ABT 法的建立和初步應(yīng)用效果分

8、析：10種待測狂犬病疫苗經(jīng)M-ABT 法檢測，結(jié)果顯示疫苗中抗原含量與NIH 法測定結(jié)果差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且具有很好的相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.927，提示M-ABT 法可用于監(jiān)測狂犬病疫苗抗原的效價(jià)變化情況。
　　 結(jié)論：1. 實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用不同細(xì)胞系和狂犬病病毒株進(jìn)行RFFIT 檢測：將致病性更弱的CTN-181毒株應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測，增加了檢測安全性；使用常見的BHK-21、MNA細(xì)胞系使更多實(shí)驗(yàn)室建立和