腎移植受者部分免疫狀態(tài)監(jiān)測指標與Trans-vivoDTH的對比研究.pdf

1、目的：腎移植是目前終末期腎功能衰竭患者的重要替代治療，但是排斥反應是器官移植后面臨的重大難題。免疫抑制劑的應用雖然降低了急性排斥反應的發(fā)生率，但是并沒有明顯改善移植受者的長期生存，這主要是由于非特異性免疫抑制劑的毒副作用所致。減少免疫抑制劑毒副作用的最理想方案是誘導免疫耐受的形成，但是在臨床還無法常規(guī)實現(xiàn)。所以根據(jù)患者的免疫功能狀態(tài)有針對性地個體化使用免疫抑制劑，既有效防止免疫抑制不足誘發(fā)的排斥反應又避免了免疫抑制過度所產(chǎn)生的藥物毒副作

2、用。受者的免疫狀態(tài)是個體化用藥的重要依據(jù)，尋找簡便實用可靠的免疫狀態(tài)監(jiān)測指標一直是移植界努力的方向。轉(zhuǎn)移體內(nèi)遲發(fā)超敏反應檢測法(Trans vivo delayed typehypersensitivity assay，Trans-vivo DTH)是公認的一種可靠的免疫狀態(tài)監(jiān)測方法，但該方法實驗過程涉及到動物(裸鼠)，且步驟煩瑣，耗時較長，臨床應用受到很大限制，主要應用于實驗研究。目前臨床仍然停留在依據(jù)受者的血肌酐水平和免疫抑制藥物濃

3、度監(jiān)測對免疫抑制劑的用量進行經(jīng)驗性調(diào)整，使得部分移植耐受患者仍舊長期終身使用較大劑量的免疫抑制劑，在造成藥物毒副作用的同時還導致醫(yī)療資源的極大浪費。本研究將Trans-vivo DTH 做為判斷腎移植受者免疫狀態(tài)的金標準，評價外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例、PRA水平、混合淋巴細胞培養(yǎng)反應組上清液中IL-2水平以及受者尿液標本中差異蛋白的臨床應用價值，試圖尋找能夠替代Trans-vivo DTH的指標，用于臨床免疫

4、耐受的監(jiān)測，指導腎移植后臨床免疫抑制劑的運用。
　　 本研究收集30例2005年1月至2008年12月在第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院腎科接受親體腎移植的供受者外周血。受者年齡26～50歲，入組時均得到患者的知情同意。受者腎功能穩(wěn)定，肌酐水平在39～147 umol/L。
　　 材料和方法：
　　 第一部分 轉(zhuǎn)移體內(nèi)遲發(fā)超敏反應檢測(Trans vivo delayed type hypersensitivityass

5、ay，Trans-vivo DTH)：將移植后受者外周血中分離的PBMCs與供者抗原一起注入免疫缺陷的小鼠(BALB/C 裸鼠)腳掌皮下，受者細胞對供者抗原反應后產(chǎn)生DTH 反應，通過測定局部腫脹程度定量檢測受者對于供者免疫反應強度。以PBS和回憶抗原(破傷風毒素)注入作為對照。分別于注射后24 h，以游標卡尺分別測量免疫缺陷小鼠(BALB/c 裸鼠)4只腳掌炎性腫脹的厚度。裸鼠腳掌皮下炎性腫脹厚度小于2.54×10-2 mm為低敏組，

6、大于2.54×10-2 mm為高敏組。
　　 第二部分：
　　 腎移植受者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例檢測：受者PBMCs（1×106個)，按照CD4+CD25+Foxp3+Treg 染色試劑盒實驗步驟，分別進行胞外CD4/CD25抗體和胞內(nèi)Foxp3抗體染色，然后在流式分析儀上檢測并分析；腎移植受者外周血中群體反應性抗體(PRA)水平檢測：采用ELISA 法檢測腎移植術(shù)后受者血清中PRA水平。結(jié)

7、果解釋：PRA（％)=(陽性反應孔數(shù) ÷40)×100％PRA≤10％為陰性，PRA＞10％為陽性；混合淋巴細胞培養(yǎng)(MLC)反應組上清液中IL-2水平檢測：用密度梯度離心法得到供受者外周血PBMCs，建立MLC 模型，在MLC 第2，4，6天分別收集培養(yǎng)液上清，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定人IL-2水平。
　　 第三部分 腎移植受者尿液中蛋白質(zhì)譜分析：
　　 在留取外周血液標本時同時留取腎移植受者尿液標本100

8、ml，放-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩Ｄ蛞簶吮窘?jīng)過離心去沉淀，過濾去雜質(zhì)，抽濾除菌，濃縮凍干，尿素溶液清洗除鹽等前期處理后進行雙向電泳，ImageMaster 軟件分析，尋找差異蛋白斑點，然后進行質(zhì)譜分析，尋找差異蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：根據(jù)裸鼠腳掌皮下炎性腫脹厚度將實驗病例劃分為低敏組和高敏組。兩組裸鼠腳掌皮下炎性腫脹厚度分別為1.72±0.44(×10-2 mm)，8.05±2.26(×10-2 mm)；

9、r>　　 第二部分：
　　 (1) 低敏組和高敏組受者外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg 比例分別為9.23±1.79(％)，1.03±1.04(％)；低敏組和高敏組的外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg 比例差異顯著，P<0.05；
　　 (2) 低敏組受者外周血中PRA的百分比均小于10％(2個標本除外)，高敏組的7例受者外周血中PRA 比例均大于10％。低敏組和高敏組的外周血中PRA 比例差

10、異顯著，P<0.05；(3) 成功建立混合淋巴細胞培養(yǎng)實驗模型并收集上清液。高敏組MLC中反應組細胞上清液中IL-2水平在培養(yǎng)的2，4，6天分別為0.889±0.070，1.637±0.214，1.069±0.100；低敏組MLC中反應組細胞上清液中IL-2水平在培養(yǎng)的2，4，6天分別為0.738±0.065，0.988±0.117，0.868±0.104。高敏組IL-2水平明顯高于低敏組，兩組中反應組細胞的IL-2水平差異顯著，P<0

11、.05；
　　 第三部分：質(zhì)譜分析得到低敏組和高敏組的雙向電泳圖譜中四個有意義的差異蛋白．低敏組表達升高的是SERPINA1亞型3 α-1-抗胰蛋白酶和人補體因子B(CFBComplement factor B)，高敏組表達升高的是AZGP1(鋅-α-2-糖蛋白)和SERPINC1Antithrombin-III(絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子-抗凝血酶-III)。
　　 結(jié)論：
　　 1、受者外周血中CD4+

12、CD25+FoxP3+Treg的比例與受者對供者免疫反應強度呈負相關。外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg的比例越高，發(fā)生排斥反應的可能性就越小。
　　 2、低敏組和高敏組的腎移植受者，其外周血中PRA水平有顯著差異，可用于免疫狀態(tài)的監(jiān)測。
　　 3、低敏組的檢測MLC 反應組細胞上清液中IL-2水平較高敏組低，說明MLC 反應組細胞上清液中IL-2水平可以作為腎移植術(shù)后預測排斥反應的一項指標。