鼠疫耶爾森氏菌外源獲得性質(zhì)粒編碼小RNA的篩選、鑒定與功能的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　鼠疫是一種自然疫源性疾病，其病原菌是鼠疫耶爾森氏菌（以下簡稱鼠疫菌）。鼠疫菌共含有3個(gè)質(zhì)粒，即pCD1、pMT1和pPCP1，pCD1質(zhì)粒為鼠疫菌和假結(jié)核耶爾森氏菌所共有，pMT1與pPCP1質(zhì)粒則是鼠疫菌在進(jìn)化過程中外源性獲得的，為鼠疫菌所特有，與鼠疫菌的致病性密切相關(guān)。
　　細(xì)菌中除了蛋白類的調(diào)控因子之外，還存在許多發(fā)揮調(diào)控作用的非編碼RNA(non-codingRNA),在細(xì)菌中也稱作小RNA(smal

2、lRNA,小RNA)。小RNA作為調(diào)節(jié)子，可參與細(xì)菌內(nèi)鐵代謝、糖代謝、群體感應(yīng)、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的調(diào)控，對原核生物生理和毒力發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　本研究利用高通量測序技術(shù)對在不同條件下生長的鼠疫菌提取它的總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，新發(fā)現(xiàn)了104個(gè)小RNA，其中包括pMT1與pPCP1質(zhì)粒上的多個(gè)小RNA，而這兩個(gè)質(zhì)粒又是鼠疫菌在進(jìn)化過程中獲得的，因此驗(yàn)證pMT1與pPCP1質(zhì)粒上小RNA的功能是鼠疫菌致病機(jī)制研究的

3、重要組成部分。本研究旨在利用Northern blot驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的小RNA，并構(gòu)建小RNA的基岡缺失株，通過一系列的表型篩選實(shí)驗(yàn)，初步探究了小RNA對鼠疫菌生存能力和致病能力的影響。
　　結(jié)果與討論：
　　(1)利用Northern blot實(shí)驗(yàn)方法共確定了10個(gè)小RNA的存在，分別為sR18、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143，又對本

4、次確定的小RNA和前期驗(yàn)證的部分小RNA做了大小和Hfq依賴性的驗(yàn)證。驗(yàn)證大小的小RNA有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15個(gè)，這些小RNA的大小基本和預(yù)測結(jié)果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表達(dá)量高于Hfq突變株，因此這些小RNA的穩(wěn)定表

5、達(dá)依賴于Hfq蛋白，sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突變株中的表達(dá)量幾乎一樣，且sR503和sR147在野生株中的表達(dá)量低于突變株，這些小RNA的穩(wěn)定表達(dá)不依賴于Hfq蛋白。
　　(2)采用基于λRed重組系統(tǒng)的基因突變技術(shù)，共成功構(gòu)建了16株小RNA缺失株分別是⊿sR4338、⊿sR4339、⊿sR4340、⊿sR3457、⊿sR3446、⊿sR6143、⊿sR378、⊿

6、sR3383、⊿sR3440、⊿sR18、⊿sR6094、⊿sR341、⊿sR6106、⊿sR6097、⊿sR3425和⊿sR3438。同時(shí)在缺失株的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了一株過表達(dá)株，即pBAD-sR3383。
　　(3)利用表型和毒力實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證這些小RNA對鼠疫菌的生理和毒力的調(diào)控關(guān)系。在生物膜形成方面，sR3446缺失后，鼠疫菌的菌落表面比野生株光滑，因此sR3446可能正調(diào)控鼠疫菌生物膜的形成。當(dāng)sR3425、sR3383、sR

7、3457和sR6143缺失后，鼠疫菌菌落表而變得更加粗糙，因此這幾個(gè)小RNA可能負(fù)調(diào)控鼠疫菌生物膜的形成。基于此我們又進(jìn)行了結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)，對生物膜形成情況做定量分析，結(jié)果顯示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143對鼠疫菌生物膜形成的調(diào)控與菌落表面褶皺實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。我們通過在正常條件、高鹽條件和酸性條件下培養(yǎng)鼠疫菌野生株和小RNA突變株分析不同菌株在脅迫條件下生長速率的變化，從而驗(yàn)證小RNA對鼠疫菌生存能力

8、的影響，結(jié)果顯示只有⊿sR3425缺失株在這三種條件下的生長速率均低于野生株，因此sR3425能夠增強(qiáng)鼠疫菌應(yīng)對外界環(huán)境變化的能力。我們通過小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小RNA對鼠疫菌毒力的影響，利用軟件GraphPad Prism5對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析并計(jì)算鼠疫菌野生株和小RNA突變株生存曲線差異的P值，當(dāng)P值≤0.05時(shí)認(rèn)為兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果顯示:⊿sR3440、⊿sR3383、⊿sR378、⊿ sR6094、⊿sR3411、⊿sR4