HIV-1 Tat、Rev蛋白與DDX3相互作用對HCV RNA復制影響的研究.pdf

1、背景與目的：
　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)的傳播途徑十分相似，約30％的HIV感染者合并HCV感染。中國和歐洲靜脈藥癮的HIV感染者中，合并感染HCV甚至可高達90％[1]。HCV患者合并感染HIV將加速丙型肝炎病程進展，同時降低抗HCV療效。近年較多的循證醫(yī)學證據(jù)顯示，對合并感染患者針對HIV進行嚴格的高效抗逆轉(zhuǎn)

2、錄病毒治療(Highly activeantiretroviral therapy，HAART)不能有效的改善這些情況，同時HCV病程加速也與CD4+T淋巴細胞數(shù)量下降無明顯關(guān)聯(lián)。有研究證實，HIV合并感染可能導致患者體內(nèi)HCV準種分布特征改變，但HCV載量及準種復雜度與CD4+T淋巴細胞數(shù)量無關(guān)[2，3]。這些證據(jù)都提示，HIV對HCV的影響可能存在免疫系統(tǒng)介導之外的其他途徑。有研究證實HCV、HIV可以共感染同一肝細胞，進而可能導致

3、兩種病毒在同一細胞內(nèi)發(fā)生相互作用[4]。HCV、HIV均為RNA病毒，且傳播途徑相似;而DDX3（DEAD-box解旋酶3）在人體細胞內(nèi)與RNA的復制過程關(guān)系密切，已有的研究證實DDX3可與HCVCore蛋白結(jié)合促進HCV復制[5，6]。同時也有學者發(fā)現(xiàn)HIV Tat蛋白可以在淋巴細胞內(nèi)誘導DDX3高表達[7];另一方面，HIV Rev蛋白可與DDX3結(jié)合在核膜上形成復合體從而影響胞漿內(nèi)DDX3的水平[8]。
　　本實驗正是基于已

4、有的研究成果，通過體外培養(yǎng)人肝癌細胞Huh7細胞株，并以此細胞株為基礎(chǔ)，利用HCV復制質(zhì)粒pCDNA3.1-JFH1構(gòu)建HCV細胞復制模型。構(gòu)建Tat、Rev蛋白及DDX3解旋酶相關(guān)表達載體，通過HCV細胞復制模型，探討Tat、Rev蛋白與DDX3解旋酶相互作用對HCV復制的影響。運用實時熒光定量qPCR、Western-blot等技術(shù)進行分析研究，從而闡明Tat、Rev蛋白與DDX3解旋酶相互作用對HCV復制的影響及其機制。
　

5、　方法:
　　1.查詢NCBI獲得Tat蛋白、Rev蛋白及DDX3的基因表達序列，并合成相關(guān)基因序列，分別構(gòu)建以熒光蛋白標記的HIV Tat表達載體pcDNA3.1-Tat-Flag-EGF、熒光蛋白標記的HIV Rev表達載體pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和熒光蛋白標記的DDX3表達載體pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag，相關(guān)表達載體進行PCR鑒定及相關(guān)序列測定，并分別轉(zhuǎn)染入Huh7細胞中，進行We

6、stern-blot檢測相關(guān)目的基因的表達。
　　2.瞬時轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JFH1重組表達載體進入Huh7細胞中，設(shè)立為對照組。將pCDNA3.1-JFH1和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag瞬時共轉(zhuǎn)染入Huh7細胞中，設(shè)立為實驗組。轉(zhuǎn)染48h后，提取總RNA進行qPCR檢測HCV RNA的表達情況;提取總蛋白進行Western-blot檢測DDX3的表達。
　　3.瞬時轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-JFH1重組表達

7、載體進入Huh7細胞中，設(shè)立為對照組。分別設(shè)立三組實驗組: a、 pCDNA3.1-JFH1、 pcDNA3.1-Tat-Flag-EGF和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重組質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染入Huh7細胞中;b、pCDNA3.1-JFH1、pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重組質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染入Huh7細胞中; b、 pCDNA3.1-JFH1、 pcDNA3.1-

8、Tat-Flag-EGF、pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重組質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染入Huh7細胞中。轉(zhuǎn)染48h后，分別提取各組總RNA進行qPCR檢測HCV RNA的表達情況;分別提取各組總蛋白Western blot檢測Tat蛋白、Rev蛋白及DDX3的表達。
　　結(jié)果與結(jié)論:
　　1.通過PCR鑒定、序列測定以及Western-blot檢測證實成功構(gòu)建了Tat蛋白

9、、Rev蛋白和DDX3的表達載體，并能在Huh7細胞株中表達。
　　2.通過qPCR測定轉(zhuǎn)染48h后比較DDX3對HCV RNA復制的影響，證實DDX3可以促進HCV RNA的復制(P=0.03)。
　　3.通過qPCR測定轉(zhuǎn)染48h后比較發(fā)現(xiàn)，Tat+DDX3對HCV RNA復制的影響無顯著差異(t=1.392，p＞0.05);而Rev+DDX3對HCV RNA復制的影響有顯著差異(t=8.778，p＜0.01)，表明Re