基于2a蛋白轉(zhuǎn)人工microRNA番茄抗CMV的研究.pdf

1、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)在番茄上造成的危害十分嚴重,可嚴重降低番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量。本試驗利用人工microRNA(artificial microRNA,amiRNA)技術(shù)使轉(zhuǎn)化的番茄具有對CMV的抗性。amiRNA技術(shù)在我國番茄抗CMV的育種研究中尚未見報道。將人工改造的植物microRNA(miRNA)轉(zhuǎn)入番茄體內(nèi),獲得的轉(zhuǎn)化番茄,對番茄抗病毒育種研究和miRNAs的研究與應(yīng)用具有重要意義。<

2、br>　　 本研究首先分析番茄中的miRNAs本底表達量,選擇表達量較高的miRNA159作為人工構(gòu)建miRNA的骨架。使用siRNA Target Finder設(shè)計靶標基因為CMV2a基因的的siRNA,并根據(jù)BLAST結(jié)果選擇一段與番茄同源性最低的片段,用其替換miRNA159的成熟序列,并將amiRNA159-2a連接于載體pBI121,獲得重組載體pBI12-amiRNA159-2a。通過農(nóng)桿菌EHA105的介導(dǎo)將重組載體pB

3、I121-amiRN159-2a,轉(zhuǎn)入番茄體內(nèi)。為了提高轉(zhuǎn)化的效率,對轉(zhuǎn)化體系的分化出芽激素、卡那霉素、脫菌素和生根激素等進行篩選,建立了優(yōu)化的轉(zhuǎn)amiRNA159-2a番茄體系。將得到的經(jīng)過卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)anaiRNA159-2a番茄再生苗進行分子鑒定,分別用PCR擴增和Southern雜交進行分子鑒定,并獲得陽性植株。獲得陽性轉(zhuǎn)化子后,轉(zhuǎn)amiRNA159-2a番茄的再生苗接種Fny-CMV,進行抗病性鑒定,結(jié)果表明轉(zhuǎn)amiRNA