Roux-en-Y胃旁路術對2型糖尿病大鼠肝臟和腸道糖異生影響的實驗研究.pdf

1、糖尿病是在世界各地日益嚴重的健康問題和主要的慢性疾病。國際糖尿病聯(lián)合會(International Diabetes Federation，IDF)估計，到2014年全球?qū)⒂?.87億人患有糖尿病，而到2035年這一數(shù)字將上升到5.92億。糖尿病及其相關并發(fā)癥將導致巨大的經(jīng)濟負擔和死亡率，糖尿病并發(fā)癥包括心臟疾病、中風、糖尿病足、糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病等。在2014年，糖尿病引起的醫(yī)療支出至少6120億美元，占成人總醫(yī)療支出的11

2、％。此外，在2014年糖尿病引起了490萬例患者死亡，這意味著每七秒就有一糖尿病患者死亡。因此，尋找新的和有效的治療糖尿病的方法是非常重要和緊迫的。
　　2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)，以胰腺胰島細胞分泌胰島素功能減退合并胰島素敏感靶器官有害的胰島素抵抗為特征，約占所有糖尿病的90％。目前，治療T2DM的主要方法包括生活方式干預、藥物和減重手術。越來越多的證據(jù)表明減重手術是目前治療伴肥胖T2

3、DM最有效的方法，它能迅速而持續(xù)地減輕體重，以及顯著改善甚至完全緩解T2DM。隨著糖尿病患病率逐年上升，過去10年中在全球進行減重手術的總數(shù)也不斷增加。2013年，全世界最常見的減重術式依次是Roux-en-Y胃旁路術(Roux-en-Y gastric bypass，RYGB)，約占所有減重手術的45％，其次為袖狀胃切除術(sleeve gastrectomy,SG)，約占總數(shù)的37％，以及可調(diào)節(jié)胃束帶術(adjustable gas

4、tric banding，AGB)，約占總數(shù)的10％。RYGB術后食物流通過小胃囊排入中段空腸，膽胰液轉(zhuǎn)流到遠端空腸，被證明能長期有效地減輕體重并且緩解諸如血脂異常、高血壓、脂肪肝、糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病等糖尿病并存病，故其被認為是減重手術的標準術式。然而，介導RYGB后抗糖尿病作用的內(nèi)在機制仍然知之甚少。
　　RYGB抗糖尿病效應的一些潛在作用機制包括激素分泌、腸道菌群和膽汁酸循環(huán)的改變等。累積的證據(jù)表明，RYGB后由于腸道早期暴

5、露于未充分消化的食糜，小腸出現(xiàn)形態(tài)學適應和葡萄糖代謝功能重構(gòu)，這可能是減重手術治療糖尿病的作用機制。近期，腸道糖異生參與調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)的一種新的功能被提出，這一功能被認為可能是減重手術治療糖尿病的作用機制。盡管肝臟和腸道糖異生功能得到了確認和較多的研究，然而糖異生在RYGB治療糖尿病中的作用還沒有定論。
　　目的:
　　在T2DM大鼠模型中觀察RYGB對葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、血清膽汁酸水平、腸道形態(tài)適應以及肝臟和腸道糖異生的

6、影響。本次研究的結(jié)果可能為闡明RYGB緩解糖尿病的潛在代謝機制提供新的見解。
　　方法:
　　1、動物與飼養(yǎng)條件
　　該動物研究獲得了上海市第六人民醫(yī)院動物實驗倫理委員會審核通過。三十只6周齡雄性SD大鼠購自中英Sippr/BK實驗動物有限公司（上海，中國）。所有動物保持在12小時光照/黑暗周期控制環(huán)境溫度(24±2℃)和濕度的單個籠中。所有的大鼠自由進食自來水和飼料，除非另有說明。經(jīng)過2周適應后，30只大鼠喂食高脂肪

7、飼料(high-fat diet，HFD)（60％脂肪，20％碳水化合物，20％蛋白質(zhì)，熱量總百分比;Research Diets，Inc.，美國）4周以誘發(fā)胰島素抵抗。高脂喂養(yǎng)后大鼠禁食12小時，腹腔注射1％鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ;35mg/kg)（Sigma公司，美國）以誘發(fā)糖尿病狀態(tài)。STZ注射七十二小時后，采集尾靜脈血液用血糖儀（Sinocare公司，中國）兩次測定非空腹血糖。非空腹血糖≥16.7 mm

8、ol/L的大鼠被認為是T2DM大鼠，T2DM大鼠被隨機分配到假手術組（Sham group，n=10）和RYGB組(RYGB group，n=10)。所有大鼠注射STZ后以普通飼料（10％脂肪，70％碳水化合物，20％蛋白質(zhì)，熱量總百分比;Research Diets，Inc.，美國）喂養(yǎng)。注射STZ一周后，對假手術組和RYGB組大鼠進行相應假手術或RYGB手術。在所有組中，體重和食物攝入量在手術后2周內(nèi)每天測量1次，隨后剩下時間每2周

9、一次。用血糖儀測量各組大鼠空腹血糖，術后2周內(nèi)每周1次，隨后每2周一次。
　　2、手術方法
　　禁食24小時后，以1％戊巴比妥鈉溶液腹腔內(nèi)注射（5 ml/kg）對大鼠進行麻醉。RYGB術以長約4cm的正中切口開腹，在胃食管交界處下方5mm從小彎側(cè)到大彎側(cè)將胃水平橫斷。近端胃以4-0絲線（寧波醫(yī)用針線，中國）單純間斷縫合關閉創(chuàng)建一個小胃囊，遠端殘余胃以相同的方法縫合關閉。在Treiz韌帶下方10厘米橫斷空腸，兩側(cè)斷端以4-0絲

10、線結(jié)扎。將遠端空腸拉到小胃囊處，分別在腸對系膜緣和近胃大彎胃前臂處切開7mm小口，小胃囊與遠端空腸以側(cè)側(cè)胃腸吻合的方式連接。攜帶膽胰液的近端空腸與Roux支在胃腸吻合口下方15cm處以側(cè)側(cè)空腸空腸吻合的方式重新連接。胃腸吻合和空腸空腸吻合均用5-0絲線（寧波醫(yī)用針線，中國）以單純間斷內(nèi)翻縫合方式進行，形成約7mm的吻合口。假手術組大鼠進行相同的開腹，在與RYGB手術相同位置進行胃腸橫斷，并在原來位置吻合，以產(chǎn)生與RYGB相同的手術和麻醉

11、應激效果。
　　手術大鼠在術后24小時開始給予葡萄糖氯化鈉溶液喂養(yǎng)，在術后4天開始恢復普通飼料（10％脂肪，70％碳水化合物，20％蛋白質(zhì)，熱量總百分比;Research Diets，Inc.，美國）喂養(yǎng)。
　　所有大鼠在術后8周禁食一晚后處死。空腸（在假手術組為屈氏韌帶下約17厘米近端空腸，在RYGB組對應空腸滋養(yǎng)支中間段）、回腸（距離回盲部約10厘米處）和肝臟活組織一份在福爾馬林中固定用于常規(guī)組織學檢查，另一份經(jīng)液氮冷卻

12、后儲存在-80℃用于實時定量RT-PCR和蛋白免疫印跡。
　　3、口服葡萄糖耐量試驗
　　在術前、術后2周和8周進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。大鼠禁食一晚后，以20％葡萄糖(1g/kg)灌胃。使用血糖儀測量空腹以及灌胃后30、60、90和120min血糖。
　　4、胰島素耐量試驗
　　在術前、術后2周和8周進行胰島素耐量試驗(ITT)。大鼠禁食一晚后，腹腔注射人胰島素（0.5 IU/kg）。采尾靜脈血測量清

13、醒大鼠空腹以及注射胰島素后30、60、90和120min血糖。
　　5、血清脂質(zhì)和總膽汁酸檢測
　　晚上禁食后，分別于術前及術后2周、8周采集清醒大鼠空腹尾靜脈血樣到含有EDTA溶液的冷卻管。在4℃離心(1006×g)15分鐘后，立即提取血清并存儲在-80℃?zhèn)溆?。血清總膽固?TC)、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(FFAs)和總膽汁酸根據(jù)使用說明用酶比色檢測試劑盒測量。
　　6、組織學分析
　　每只大鼠的空腸和回

14、腸組織標本用石蠟包埋后切片。將切片用蘇木精和伊紅(H&E)染色，通過光學顯微鏡觀察。對于腸道形態(tài)適應的評價，由一位獨立的病理專家在顯微鏡下觀察(×100)所有組織切片后進行評估。
　　結(jié)果:
　　1、空腹血糖水平
　　RYGB組和假手術組大鼠術前空腹血糖水平?jīng)]有差別。假手術組大鼠術后空腹血糖逐漸升高，而RYGB組大鼠術后空腹血糖增長緩慢，并且于術后1周開始保持平穩(wěn)。術后4周開始，RYGB組大鼠空腹血糖水平顯著低于假手術

15、組。
　　2、體重和攝食量
　　RYGB組和假手術組大鼠術前體重和攝食量沒有差別。兩組大鼠于術后1周體重下降到最低，假手術組大鼠體重于術后2周恢復到術前水平，而RYGB組大鼠從術后2周開始體重增長變緩。術后3周開始直至術后8周，RYGB組大鼠體重顯著低于假手術組。術后2周開始直至術后8周，RYGB組大鼠攝食量顯著低于假手術組。
　　結(jié)論:
　　1、RYGB能顯著減輕T2DM大鼠模型的體重，并顯著減少其攝食量。