化膿性鏈球菌溶血素O基因功能初步研究.pdf

1、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)是一類嚴(yán)格以人作為宿主的鏈球菌，廣泛存在于人的糞便和鼻咽部位，可引起從普通非侵襲性疾病如咽炎、猩紅熱、膿皰病到侵襲性和嚴(yán)重侵襲性疾病如風(fēng)濕熱等疾病的常見人類專性致病菌。鏈球菌溶血素O(Streptolysin O;SLO)是鏈球菌產(chǎn)生的重要毒素之一。它不僅可以引起溶血，同時(shí)也可強(qiáng)烈引起真核細(xì)胞膜損傷，影響細(xì)胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程，使靶細(xì)胞釋放胞內(nèi)成分并致溶解，SLO在鏈球菌感染過程

2、中起著重要作用。生物信息分析化膿性鏈球菌溶血素O蛋白結(jié)構(gòu)表明，SLO蛋白除含有由461氨基酸殘基組成的溶血活性結(jié)構(gòu)域Thiol_cytolysin外，在N端還有一跨膜結(jié)構(gòu)域。
　　本研究利用pET101-GENE蛋白表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建出高表達(dá)具有SLO活性的重組蛋白重組子，采用鎳柱親和層析分離技術(shù)，純化目的蛋白;純化蛋白SDS-PAGE檢測分析表明，重組蛋白與預(yù)測的溶血活性結(jié)構(gòu)域的分子量相一致;溶血實(shí)驗(yàn)顯示，純化重組蛋白具有溶血活

3、性。以純化的重組蛋白為免疫原，對大鼠進(jìn)行4次免疫，所獲得免疫血清經(jīng)Elisa檢測，抗SLO血清效價(jià)達(dá)到1∶12800;Western Blot檢測豬鏈球菌、馬鏈球菌和化膿性鏈球菌中的鏈球菌溶血素結(jié)果顯示，抗SLO多克隆抗體僅能與化膿性鏈球菌SLO發(fā)生反應(yīng)，表明所研究制備化膿性鏈球菌SLO活性結(jié)構(gòu)重組蛋白抗原具有的較好特異性。
　　通過基因敲除的方法，構(gòu)建化膿性鏈球菌SLO基因跨膜結(jié)構(gòu)缺失株△TM和SLO基因活性結(jié)構(gòu)缺失株△Thio

4、l_cytolysin，溶血活性分析驗(yàn)證，無論是跨膜結(jié)構(gòu)缺失株還是溶血活性結(jié)構(gòu)域缺失突變株，均喪失SLO溶血，進(jìn)一步通過Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，在兩株突變株培養(yǎng)基上清中不能檢測到SLO的雜交信號，因此推斷，跨膜結(jié)構(gòu)缺失可能影響了SLO的分泌。比較SLO基因跨膜結(jié)構(gòu)域缺失菌株，SLO溶血活性結(jié)構(gòu)域缺失菌株與化膿性鏈球菌野生菌株NADase、GAPDH和SpeB等毒力因子活性，結(jié)果表明，三株菌NADase活性無明顯差異。檢測細(xì)胞表

5、面的GAPDH活性發(fā)現(xiàn)，跨膜結(jié)構(gòu)缺失株與Thiol_cytolysin缺失株的活性分別是野生株的17.3％和90.5％。對化膿性鏈球菌分泌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，跨膜結(jié)構(gòu)缺失株SpeB的成熟明顯推遲，而缺失失活株SpeB的成熟稍微提前。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，跨膜結(jié)構(gòu)缺失株與血活性結(jié)構(gòu)域缺失株的相對粘附數(shù)是野生株的分別為58％和129％。同時(shí)，利用臺(tái)盼藍(lán)染色分析菌株上清液對宿主細(xì)胞通透性改變情況發(fā)現(xiàn)，兩株突變株改變細(xì)胞通透性能力