Cx6基因敲除胎鼠心臟近端流出道隔心肌化過程的關(guān)鍵基因.pdf

1、心臟錐干部畸形是常見的復(fù)雜性先天性心臟病(先心病),是導(dǎo)致兒童死亡的主要原因之一。近端流出道隔對(duì)錐干部的發(fā)育至關(guān)重要。細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Connexin43,Cx43)基因敲除(Cx43KO)小鼠心臟錐干部發(fā)育畸形,流出道梗阻,生后即出現(xiàn)死亡,表明Cx43在心臟流出道發(fā)育過程中起著重要作用。Cx43是連接蛋白家族中的重要一員,作為一種重要的通訊連接,是細(xì)胞間代謝偶聯(lián)、沖動(dòng)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)“心肌化”過程是心臟近端流出道隔發(fā)育

2、中的一個(gè)重要事件。調(diào)控心肌化的基因及相關(guān)分子機(jī)制的研究正在成為研究熱點(diǎn)。本課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)Cx43KO小鼠心臟近端流出道隔心肌化過程異常,提示復(fù)雜的分子機(jī)制參與心臟流出道梗阻的發(fā)生。為此,本課題擬研究Cx43KO小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變,篩選可能導(dǎo)致Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的關(guān)鍵基因,進(jìn)一步闡述Cx43KO小鼠心臟流出道梗阻的發(fā)病機(jī)制。
　　 第一部分 Cx43基因敲除小鼠心臟發(fā)育心肌化過程中的形態(tài)

3、學(xué)研究
　　 研究目的
　　 利用Cx43基因敲除小鼠模型,探討Cx43基因敲除小鼠與野生型小鼠在心臟心肌化發(fā)育過程中的形態(tài)學(xué)差異。
　　 材料與方法
　　 成年2月齡Cx43基因敲除雜合子小鼠交配,選取ED11.5～15.5的胎鼠以及新生小鼠為研究對(duì)象,根據(jù)基因型分為Cx43基因敲除純合子(Cx43-/-),雜合子(Cx43+-/-)及野生型(Cx43+/+),采用PCR方法鑒定基因型。顯微解剖及HE染

4、色觀察心臟結(jié)構(gòu);免疫組織化學(xué)法測(cè)定橫紋肌肌動(dòng)蛋白α-SCA的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1.所有Cx43-/-小鼠出生后很快死亡,其心臟大體解剖上可見右室流出道圓錐部明顯膨出。Cx43+/-新生鼠心臟無(wú)明顯異常。
　　 2.組織切片HE染色顯示,出生后死亡的Cx43-/-小鼠右室流出道圓錐部組織異常增生,小梁間囊明顯,結(jié)構(gòu)排列紊亂,流出道狹窄,右室壁心肌致密層的厚度較野生型變薄。Cx43+/-新生鼠心臟無(wú)明顯異常。

5、
　　 3.野生型胎鼠心臟近端流出道墊組織于ED11.5開始有融合趨勢(shì),ED13.5完成融合;心肌化過程從ED12.5開始,ED15.5完成。整個(gè)心肌化過程呈現(xiàn)心肌由流出道隔外側(cè)向內(nèi)側(cè)延伸的趨勢(shì)。而在Cx43-/-胎鼠,α-SCA在近端流出道墊組織的表達(dá)減少,尤其是在ED13.5～15.5為著,說(shuō)明心肌化過程延遲。Cx43+/-的變化不明顯。
　　 小結(jié)
　　 1.Cx43-/-小鼠以右室流出道異常增生引起的梗阻

6、性畸形為主要表型特征。
　　 2.Cx43-/-小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯。
　　 第二部分 Cx43基因敲除胎鼠心肌化過程中心臟流出道組織基因表達(dá)譜的變化
　　 研究目的
　　 觀察Cx43-/-小鼠胚胎心臟近端流出道組織中基因表達(dá)譜的改變,篩選可能導(dǎo)致Cx43-/-小鼠流出道梗阻的相關(guān)基因。
　　 材料與方法
　　 以ED14.5的Cx43-/-和Cx43+/+胎鼠心臟近端流出道

7、部為研究材料,分別提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;并在體外轉(zhuǎn)錄為eRNA,同時(shí)進(jìn)行生物素標(biāo)記及片段化;再與Afymetrix4302.0基因芯片進(jìn)行雜交。雜交信號(hào)經(jīng)掃描后,應(yīng)用相關(guān)生物信息軟件分析基因表達(dá)情況。
　　 結(jié)果
　　 1.與Cx43+/+組相比較,Cx43-/-組中表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因共有143個(gè),表達(dá)下調(diào)2倍以上的基因有235個(gè)。其中表達(dá)差異的基因參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期等主要生理過程。
　　 2.

8、進(jìn)一步篩查發(fā)現(xiàn),TGFβ/BMP信號(hào)通路上的5個(gè)基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等與心肌化過程相關(guān)的3個(gè)基因在Cx43-/-組有明顯變化。
　　 小結(jié)
　　 1.Cx43基因敲除后可以引起多個(gè)基因的表達(dá)異常,其中包括與流出道發(fā)育密切相關(guān)的一些基因。
　　 2.Cx43-/-胎鼠心臟流出道組織中TGFβ/BMP信號(hào)通路RhoA,TGF132,Smad6,Bmp2,及Bmpr2等基因以及與心肌化過程相關(guān)的Ssr1

9、,Ptk2,Bmp6等基因的差異表達(dá)可能與其流出道梗阻的發(fā)生相關(guān)。
　　 第三部分 Reaitime RT-PCR驗(yàn)證關(guān)鍵基因的差異表達(dá)
　　 研究目的
　　 對(duì)第二部分篩選出TGFβ/BMP信號(hào)通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2及Bmpr2等5個(gè)基因以及與心肌化過程相關(guān)的Ssr1,Ptk2,Bmp6等3個(gè)基因在內(nèi)的共8個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行Realtime RT-PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證其變化趨勢(shì)是否與基因芯片結(jié)果

10、相同。
　　 材料及方法
　　 以ED14.5的Cx43-/-和Cx43+/+胎鼠心臟近端流出道部為研究材料,分別提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;對(duì)芯片檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的5個(gè)TGFβ/BMP信號(hào)通路上的基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等與心肌化過程相關(guān)的基因,在ED14.5利用Realtime RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果
　　 1.Realtime RT-PCR驗(yàn)證其中的5個(gè)基因包括TGF

11、β32,Ssr1、RhoA、Bmp6、Ptk2的變化,表達(dá)量明顯上調(diào),表明其變化趨勢(shì)基本與基因芯片結(jié)果相同。
　　 2.Realtime RT-PCR驗(yàn)證其中的3個(gè)基因包括Bmpr2、Bmp2、smad6的變化,表達(dá)量明顯下調(diào),表明其變化趨勢(shì)基本與基因芯片結(jié)果相同。
　　 小結(jié)
　　 對(duì)第二部分篩選出TGFβ/BMP信號(hào)通路RhoA,TGFβ2,Smad6,Bmp2及Bmpr2等5個(gè)基因以及與心肌化過程相關(guān)的Ss

12、r1,Ptk2,Bmp6等3個(gè)基因在內(nèi)的8個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行Realtime RT-PCR驗(yàn)證,其變化趨勢(shì)與基因芯片的結(jié)果一致。
　　 總結(jié)
　　 Cx43基因敲除純合子小鼠胚胎期近端流出道隔心肌化遲滯,提示Cx43在心肌化的發(fā)生過程中起著重要作用。利用基因芯片技術(shù)初步篩選出與Cx43-/-胎鼠TGFβ/BMP信號(hào)通路上的5個(gè)基因以及Ssr1,Ptk2,Bmp6等與心肌化過程相關(guān)的多個(gè)基因差異表達(dá),并行Realtim RT-