采用大鼠向肌樣細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合藻酸鈣凝膠構(gòu)建組織工程化肌肉的初步研究.pdf

1、[目的]
　　 壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)是成年女性較常見(jiàn)的疾病,隨年齡增長(zhǎng)癥狀加重,嚴(yán)重影響中老年婦女的身心健康。我們擬采用經(jīng)肌肉分化誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和藻酸鈣復(fù)合凝膠作尿道內(nèi)口注射,一方面增加尿道阻力,一方面利用經(jīng)肌肉分化誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)和替代相關(guān)部位細(xì)胞的退行性改變,以修復(fù)盆底肌肉、筋膜及尿道固有括約肌的生理功能。本實(shí)驗(yàn)作為本研究課題的一部分,對(duì)大鼠骨髓間充

2、質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derired mesenchymal stem cells,BMSCs)進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)及向肌樣細(xì)胞分化誘導(dǎo)的技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和分析。探討以可降解生物材料藻酸鈣(Alginate)凝膠為支架混合大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)后的肌樣細(xì)胞,構(gòu)建組織工程化可注射性材料的特性。
　　 [材料和方法]
　　 第一部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng):通過(guò)新生SD大鼠(1周齡)骨髓提取

3、分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,在體外培養(yǎng)增殖,觀察并通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定得到的細(xì)胞情況。經(jīng)鑒定后,擴(kuò)增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用吖啶橙(Acridine Orange,AO)作示蹤染色,為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 第二部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究:以5-氮雜胞苷10μ mol/L作用于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24小時(shí),誘導(dǎo)其向肌樣細(xì)胞分化,繼續(xù)培養(yǎng)3周后,通過(guò)蘇木精一伊紅(H&E)、結(jié)蛋白(Desmin)、α-橫

4、紋肌動(dòng)蛋白(α-SMA)免疫組織化學(xué)染色觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化情況。
　　 第三部分:制備藻酸鈣凝膠的研究:將2％藻酸鈉溶液分別與5％、2％、1％三種不同濃度的CaCl2按體積比1:1、5:1、10:1三種比例混合,觀察在4℃、室溫和37℃下形成的藻酸鈣凝膠的大體物理性狀的變化。
　　 第四部分:以藻酸鈣凝膠為支架構(gòu)建組織工程學(xué)研究:以2％藻酸鈉溶液與1％濃度的CaCl2按體積比5:1混合制成可注射性藻酸鈣凝膠,以藻

5、酸鈣凝膠作為支架復(fù)合大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)后的肌樣細(xì)胞分別注射于SD大鼠(體重200～250g)背部皮下和四肢肌肉中,觀察大鼠背部凝膠形成皮丘的體積變化及4周、8周后組織塊取出后,免疫組化染色觀察干細(xì)胞及肌樣細(xì)胞在藻酸鈣凝膠支架內(nèi)的生長(zhǎng)吸收情況。
　　 [結(jié)果]
　　 第一部分:從新生大鼠四肢長(zhǎng)骨中提取骨髓,經(jīng)貼壁法分離,可得到較為純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。原代培養(yǎng)2天后,干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)由均一單個(gè)圓梭形逐漸貼

6、壁,呈梭形或紡錘形生長(zhǎng),細(xì)胞核呈圓形或橢圓形。繼續(xù)培養(yǎng)5～10天后,細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90％,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大變化,可見(jiàn)紡錘形和星形多突起樣生長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,經(jīng)0.25％的胰蛋白酶+2g/LEDTA消化后按1:3傳代。10cm培養(yǎng)皿長(zhǎng)滿后可得細(xì)胞量約3～5×106個(gè)。經(jīng)2～3次傳代后,P2、P3代為比較純凈的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗體CD29陽(yáng)性率89.6％、CD105陽(yáng)性率46.0％,CD34、CD45呈陰性反應(yīng)。

7、培養(yǎng)所得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)吖啶橙(AcridineOrange,AO)染色有強(qiáng)綠色熒光反應(yīng)。
　　 第二部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)24小時(shí),繼續(xù)培養(yǎng)3周后,細(xì)胞成簇密集生長(zhǎng)。誘導(dǎo)后細(xì)胞部分變?yōu)槎嘟切螤?呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng),胞內(nèi)可見(jiàn)趨于融合的多核肌管樣細(xì)胞結(jié)構(gòu),未誘導(dǎo)的干細(xì)胞,誘導(dǎo)后培養(yǎng)1周的細(xì)胞和誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)3周的細(xì)胞做免疫組織化學(xué)染色顯示,普通H&E染色三組細(xì)胞未見(jiàn)明顯差別。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)蛋白和α—橫紋

8、肌動(dòng)蛋白兩種蛋白幾乎不著色,誘導(dǎo)后培養(yǎng)1周的細(xì)胞結(jié)蛋白(Desmin)染色為淡藍(lán)色、α—橫紋肌動(dòng)蛋白(α-SMA)染色為褐色,誘導(dǎo)后3周的細(xì)胞兩種蛋白染色較1周時(shí)明顯增強(qiáng),呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　 第三部分:2％藻酸鈉溶液為黃褐色粘性液體,無(wú)氣味、透明。藻酸鈣凝膠為無(wú)色透明或乳白色,形態(tài)及質(zhì)地根據(jù)配比不同隨之變化。按體積比1:1加入CaCl2后凝膠形成固性好,質(zhì)地較硬。按體積比5:1加入CaCl2震蕩混勻后形成均一凝膠層,凝膠均質(zhì),

9、周圍無(wú)多余液體。24小時(shí)后,1％CaCl2濃度組凝膠仍有流動(dòng)性,易碎?？勺鳛榭勺⑸湫圆牧?。按體積比10:1加入CaCl2后藻酸鈉溶液有明顯殘余,凝膠不能即刻形成,均可震蕩混勻,形成凝膠體積較前兩種體積比各組均小,質(zhì)地軟,流動(dòng)性強(qiáng),易碎。4～37℃不同溫度對(duì)凝膠的形成速度及成型后的性狀無(wú)明顯影響,凝膠烘干后體積明顯縮小至原體積的5～10％左右。掃描電鏡觀察3種凝膠表面微結(jié)構(gòu)見(jiàn)CaCl2濃度越小,形成的凝膠微結(jié)構(gòu)空隙越大。
　　 第

10、四部分:藻酸鈣凝膠中混合細(xì)胞后掃描電鏡觀察見(jiàn)細(xì)胞均勻散布于藻酸鈣凝膠表面和內(nèi)部空隙中。SD大鼠體內(nèi)單純注射細(xì)胞,1～2天后由于培養(yǎng)液被很快吸收,無(wú)法進(jìn)行組織采集。凝膠組及干細(xì)胞、肌樣細(xì)胞復(fù)合凝膠組大鼠背部凝膠1月后縮小50％以上,2月后凝膠體積縮小80％左右。凝膠注射4周后取出皮下凝膠塊,凝膠塊體積較注射前明顯減小,凝膠塊外形成明顯包膜,4周、8周時(shí)取出大鼠皮下及四肢肌肉組織塊做免疫組織化學(xué)染色和熒光示蹤照相,顯示凝膠樣本有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

11、,梭形成纖維細(xì)胞樣包膜形成,凝膠邊緣有新生血管長(zhǎng)入。BMSCs和肌樣細(xì)胞在凝膠中均有生長(zhǎng),肌樣細(xì)胞在皮下和肌肉內(nèi)特異蛋白表達(dá)較弱,注射于肌肉中的BMSCs在8周時(shí)有輕度結(jié)蛋白和橫紋肌動(dòng)蛋白表達(dá),但均未見(jiàn)明顯新生肌肉樣組織生長(zhǎng)。
　　 [結(jié)論]
　　 從新生大鼠四肢長(zhǎng)骨中提取骨髓,靠密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離,可得到較為純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,方法簡(jiǎn)便高效。
　　 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)活力好,增殖迅速,可大量培

12、養(yǎng)增殖。
　　 經(jīng)5-氮雜胞苷作用后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有明顯的肌樣蛋白表達(dá),說(shuō)明5-氮雜胞苷可誘導(dǎo)干細(xì)胞向肌樣細(xì)胞分化,但5-氮雜胞苷的濃度和作用時(shí)間必須限定在一定范圍內(nèi)。
　　 藻酸鈉溶液與不同濃度的CaCl2及按不同體積比混合所得藻酸鈣凝膠性質(zhì)也不盡相同,高濃度的CaCl2參與形成的藻酸鈣凝膠硬度和強(qiáng)度較大。要選用藻酸鈣凝膠作為可注射性材料,CaCl2的濃度也需要控制在一定范圍之內(nèi)。
　　 藻酸鈣凝膠復(fù)合BM