益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌致腦膜炎的初步研究.pdf

1、目的：
　　本研究的主要目的:評(píng)價(jià)鼠李糖乳桿菌(LGG)和分離自某健康足月新生兒糞便的脆弱擬桿菌(BF SK08)兩種益生菌能否抑制阪崎克羅諾桿菌黏附和侵襲小腸上皮細(xì)胞(Caco-2)，從而預(yù)防和治療克羅諾桿菌引起的菌血癥和腦膜炎。(1)體外利用Caco-2細(xì)胞模型，檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附、侵襲性及兩種益生菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性能。(2)采用競(jìng)爭(zhēng)排斥置換法，探討兩種益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌黏附侵襲Caco

2、-2細(xì)胞的作用，確定益生菌黏附抑制阪崎克羅諾桿菌侵襲Caco-2細(xì)胞的方式。(3)運(yùn)用westem blot驗(yàn)證兩種益生菌對(duì)主要粘蛋白基因MUC-2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，益生菌能否拮抗阪崎克羅諾桿菌誘導(dǎo)的粘蛋白基因表達(dá)下降，發(fā)揮其拮抗致病菌黏附侵襲作用。(4)益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌腸道血源性轉(zhuǎn)移的新生大鼠模型建立及預(yù)防、治療試驗(yàn)。通過以上研究，觀察鼠李糖乳桿菌LGG和新型脆弱擬桿菌SK08兩種益生菌能否抑制阪崎克羅諾桿菌引起的菌血癥和腦膜炎

3、，初步探討益生菌抑制致病菌的黏附、侵襲和預(yù)防血行轉(zhuǎn)移入腦是否與調(diào)節(jié)腸道粘液蛋白基因表達(dá)相關(guān)。
　　方法：
　　1、體外阪崎克羅諾桿菌黏附、侵襲實(shí)驗(yàn)
　　2、益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌黏附、侵襲實(shí)驗(yàn)
　　3、益生菌誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞MUC-2基因表達(dá)
　　4、阪崎克羅諾桿菌腸道血源性轉(zhuǎn)移的新生大鼠模型
　　結(jié)果：
　　1、阪崎克羅諾桿菌ATCC29544對(duì)Caco-2細(xì)胞具有黏附、侵襲性。其中以大腸桿菌

4、E44（E coli K1株）作為陽(yáng)性對(duì)照，DH5α為陰性對(duì)照，經(jīng)3h黏附后，其黏附作用比陽(yáng)性對(duì)照組E44?。ㄏ鄬?duì)黏附率為31.3％），比陰性對(duì)照組DH5α大（P＜0.05）;待細(xì)菌黏附3h后，加入慶大霉素進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果顯示其侵襲作用與陽(yáng)性對(duì)照組E44接近，比陰性對(duì)照組DH5α大（P＜0.05）。分別在1、3和5h時(shí)間點(diǎn)取培養(yǎng)板上細(xì)菌涂板，結(jié)果顯示阪崎克羅諾桿菌在感染細(xì)胞3h后對(duì)細(xì)胞的黏附性和侵襲性最大，隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌的黏

5、附能力有所下降(P＜0.05)。
　　2、益生菌（鼠李糖乳桿菌LGG和脆弱擬桿菌SK08）抑制阪崎克羅諾桿菌黏附、侵襲Caco-2細(xì)胞，且呈劑量依賴性。分別用不同濃度(106，107，108)的BF SK08和LGG進(jìn)行抑制ATCC29544黏附、侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著BF SK08和LGG濃度的增加，阪崎克羅諾桿菌的相對(duì)侵襲率明顯下降，說明侵入到Caco-2細(xì)胞中的致病菌明顯減少，抑制作用明顯(P＜0.05)。
　　采用競(jìng)

6、爭(zhēng)排斥置換實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組侵襲率均降低（P＜0.05），而競(jìng)爭(zhēng)和排斥組抑制作用比置換組大，排斥組的抑制作用比競(jìng)爭(zhēng)組大，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異（P＜0.05），表明BF SK08和LGG兩種益生菌對(duì)抑制致病菌阪崎克羅諾桿菌4侵襲Caco-2細(xì)胞具有一定作用，同時(shí)間接指導(dǎo)益生菌的預(yù)防效果強(qiáng)于治療效果。
　　3、用WB法對(duì)益生菌拮抗致病菌黏附侵襲的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，提取各組細(xì)胞總蛋白，采用β-actin做內(nèi)參，WB法

7、檢測(cè)益生菌和致病菌誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞Caco-2的Mucin基因的表達(dá)。結(jié)果顯示加入益生菌的Caco-2細(xì)胞MUC-2基因明顯上調(diào)，而未加入益生菌組的MUC-2基因表達(dá)則顯著降低，共同加入益生菌和致病菌的組則基因表達(dá)無(wú)明顯變化，說明益生菌誘導(dǎo)的MUC-2基因表達(dá)上調(diào)可能成為其拮抗致病菌的保護(hù)機(jī)制之一。MUC-2隨著機(jī)體的病理性的改變而發(fā)生變化，會(huì)出現(xiàn)黏蛋白表達(dá)的異常包括黏蛋白的基因水平及其蛋白質(zhì)水平的改變，硫基化程度的降低、糖基化和蛋白質(zhì)高

8、級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的改變，從而影響他們的保護(hù)功能的發(fā)揮，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)闡明MUC-2基因在人體結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能和進(jìn)一步研究該基因與益生菌、致病菌之間存在一定關(guān)系。說明益生菌對(duì)致病菌黏附附侵襲腸上皮細(xì)胞的抑制作用離不開宿主本身攜帶的MUC-2基因的保護(hù)作用。
　　4、在阪崎克羅諾桿菌腸道血源性轉(zhuǎn)移的新生大鼠中，同時(shí)設(shè)置預(yù)防組和治療組，48 h后取腸道內(nèi)容物、血液、腦脊液標(biāo)本檢測(cè)。結(jié)果顯示，預(yù)防組和治療組中，益生菌+致病

9、菌組乳鼠腸道定植的阪崎克羅諾桿菌數(shù)量顯著少于對(duì)照組（P＜0.05），未發(fā)生菌血癥，腦脊液中也未檢測(cè)到ATCC29544株。對(duì)照組灌胃致病菌(108CFU)后，預(yù)防組20只乳鼠中20只出現(xiàn)菌血癥（＞105cfu/mL），14只腦脊液中出現(xiàn)ATCC29544株。治療組20只乳鼠中20只出現(xiàn)菌血癥（＞105cfu/mL），15只腦脊液中出現(xiàn)ATCC29544株。而益生菌預(yù)防組20只乳鼠中，LGG組有12只出現(xiàn)菌血癥(＞105cfu/mL)，S

10、K08組有11只出現(xiàn)菌血癥(＞105cfu/mL)，混合益生菌組有11只出現(xiàn)菌血癥（＞105cfu/mL），三組腦脊液中均沒有出現(xiàn)菌ATCC29544株;益生菌治療組20只乳鼠中，LGG組有14只出現(xiàn)菌血癥(＞105 cfu/mL)，SK08組和混合益生菌組有12只出現(xiàn)菌血癥（＞105cfu/mL），SK08組和混合益生菌組腦脊液中均沒有出現(xiàn)ATCC29544株，而LGG組腦脊液中有1只出現(xiàn)ATCC29544株。結(jié)果表明:脆弱擬桿菌SK

11、08和益生菌LGG可以抑制致病菌穿透腸屏障，從而減少了進(jìn)入血腦屏障的細(xì)菌數(shù)量，用脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG預(yù)防和治療小鼠腦膜炎具有一定效果。
　　結(jié)論：
　　1、脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG能黏附于腸上皮細(xì)胞，并能顯著抑制阪崎克羅諾桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附、侵襲;
　　2、脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG可上調(diào)腸上皮細(xì)胞粘蛋白MUC-2基因表達(dá)，保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受致病菌的損傷，這可能成為拮抗致病菌黏附、侵襲的保