山茱萸不同栽培品種葉綠休DNA的SCAR標(biāo)記研究.pdf

1、山茉萸為山茱萸科(cornaceae)植物山茉萸(Cornus officinalis SiebZucc)除去果核的干燥成熟果肉，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫等功效，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛等，為當(dāng)前大力發(fā)展的中藥材之一?，F(xiàn)代研究證明山茱萸具有較好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能和顯著的降血糖作用，因此中醫(yī)臨床用量較大；同時(shí)作為常用中成藥(如六味地黃丸等)原料，中藥生產(chǎn)用量也很大，主產(chǎn)于我國(guó)河南、陜西和浙江等省。我國(guó)學(xué)者根據(jù)山茉萸不同栽培品種果實(shí)的形狀、

2、大小、重量、顏色等對(duì)種內(nèi)性狀變異、類型劃分進(jìn)行了初步研究，分為橢圓形果型、長(zhǎng)圓柱形果型、圓柱形果型、短圓柱形果型、長(zhǎng)梨形果型、短梨形果型。國(guó)內(nèi)外對(duì)山茱萸的研究主要集中對(duì)其化學(xué)成分及藥理作用的研究，但沒(méi)有變異類型在cpDNA方面的深入研究，不利于山茱萸種質(zhì)資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用，本實(shí)驗(yàn)室己在DNA分子水平上建立了山茱萸各品種的RAPD指紋數(shù)據(jù)庫(kù)并成功獲得了山茉萸及其不同栽培品種的特異SCAR標(biāo)記，還獲得了山茱萸ITS完全序列。
　　

3、 葉綠體DNA種內(nèi)的多態(tài)性對(duì)以葉綠體DNA為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的建立有影響，特別對(duì)等級(jí)較低的分類單位(如種的水平)系統(tǒng)演化關(guān)系的建立影響特別顯著，不了解葉綠體DNA種內(nèi)差異是會(huì)得到不可靠的系統(tǒng)演化關(guān)系的。高等植物葉綠體DNA的保守性并非是絕對(duì)的，在較多類群里都有不同程度的葉綠體DNA種內(nèi)變異。因此，對(duì)cpDNA種內(nèi)變異的正確估計(jì)或了解是非常重要的。本實(shí)驗(yàn)收集了河南、陜西等主產(chǎn)地山茉萸各品種的標(biāo)本共130份，提取其葉綠體DNA，并進(jìn)行RA

4、PD分析，主要結(jié)果如下：
　　 1.在常規(guī)的葉綠體DNA提取方法的基礎(chǔ)上，對(duì)提取條件進(jìn)行了改進(jìn)，該法從山茉萸葉片中提取的葉綠體DNA收率為351 μ g/ml～2049μ g/ml，經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)，紫外吸收檢測(cè)表明，提取的總DNA雜質(zhì)少且APD擴(kuò)增效果良好。
　　 2.對(duì)RAPD擴(kuò)增反應(yīng)體系和溫度循環(huán)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化：(1)反應(yīng)體系：25 μ l反應(yīng)體系，其中10×bufer2.5μ1，Dntp(2.5mmol/L)3

5、.0μ1，Mg2+(25 mmool/L)3.0 μ1，引物(2μmol/L)3.0 μ 1，模板DNA(0.351 μ g/μ 1～2.049 μg/μ1)3.0μ1，Taq酶(5U/μ1)1μ1，去離子水9.5 μ1l。擴(kuò)增產(chǎn)物在l×TAE的電泳緩沖液中用1.2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓為每厘米3.4伏，電泳完畢用0.5 μg/ml的EB染色，拍照。
　　 (2)擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，變性94℃，1 min；退火35

6、℃，1 min；延伸72℃，1 min；72℃5 mi。Ll補(bǔ)齊。其中變性94℃到退火35℃的降溫速度延長(zhǎng)l min，退火35℃到延伸72℃的升溫速度延長(zhǎng)1min，共35個(gè)循環(huán)。
　　 3.從100條上海生工S系列隨機(jī)引物和實(shí)驗(yàn)室以前合成的W系列引物中篩選出15條擴(kuò)增好，多態(tài)性穩(wěn)定的引物。將這些引物用于130份材料的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為200 bp～2000 bp。從1 5個(gè)引物產(chǎn)生的譜帶中共獲得57個(gè)位點(diǎn)，其中40個(gè)位點(diǎn)具有多

7、態(tài)性，多態(tài)率達(dá)到70.18％，說(shuō)明樣品具有很好的遺傳多樣性。
　　 本實(shí)驗(yàn)以各樣本間的遺傳距離為聚類統(tǒng)計(jì)變量，采用SPSS16.0軟件計(jì)算DICE遺傳相似性系數(shù)，Between—groups Linkage方法聚類構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)系圖。由聚類圖可以看到，紡錘形果型自成一類，其次是圓柱形果型和短圓柱形果型聚成一類，與另外幾種果型的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。長(zhǎng)梨形果型和短梨形果型親緣關(guān)系較近，并且與親緣關(guān)系最近的長(zhǎng)圓柱形果型和橢圓形果型聚成一類。

8、從樹(shù)狀圖也可以看出各栽培品種之間的遺傳關(guān)系，長(zhǎng)圓柱形果型和橢圓形果型首先聚在一起，其次長(zhǎng)梨形果型和短梨形果型聚在一起，接著這兩類合二為一，后與紡錘形果型合并，之后圓柱形果型和短圓柱形果型聚在一起，晟終和其他果型聚為一大類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為山茉萸按照不同果型的分類提供了cpDNA分子水平的依據(jù)。
　　 4.從RAPD中篩選特異性的條帶進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序，如ST479，根據(jù)測(cè)得的序列，用Primer Premierer(V5.0)設(shè)計(jì)了

9、5對(duì)SCAR特異性引物，經(jīng)過(guò)篩選得到結(jié)果的引物一共2對(duì)。用篩選出來(lái)的引物對(duì)山茱萸不同栽培品種及其同科植物、混偽品材料進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件得到幾條引物通用的PCR．反應(yīng)體系：(1)50 μ 1反應(yīng)體系：其中10×PCR buffer5.0 μ 1，Dntp(2.5mM)6.0 μ 1，Mg2+(25：Mm)6.0 μ 1，引物(10 u M)各3.0 μ1，模板DNA 6.0 μ 1，Taq酶(5U/μ 1)2.5 μ 1，去離

10、子水17.5μ1。擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE電泳緩沖液中用1.5％瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢用0.5 μ g/ml的EB染色，拍照。(2)擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性8 min，變性94℃，1 min：復(fù)性45℃(ST479C)或55℃(ST479E)，1 min；延伸72℃，1.5 min；40個(gè)循環(huán)，72℃10 min補(bǔ)齊。
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：根據(jù)特異性條帶ST479序列設(shè)計(jì)的SCAR引物ST479C對(duì)山茉萸及山楂、葡萄和株術(shù)樣本的c

11、pDNA進(jìn)行SCAR．?dāng)U增(圖31)，山茉萸擴(kuò)增產(chǎn)生單一的譜帶，而山楂、葡萄和株木則產(chǎn)生二至四條譜帶，可以做為鑒別山茱萸的依據(jù)：根據(jù)特異性條帶ST479序列設(shè)計(jì)的SCAR引物ST4。79E對(duì)7個(gè)山茉萸品種及株木、四照花、葡萄、山楂樣本的cpDNA進(jìn)行SCAR擴(kuò)增(圖32)，發(fā)現(xiàn)7個(gè)山茉萸品種均能產(chǎn)生單一的PCR產(chǎn)物，而且譜帶的大小與原始的RAPD標(biāo)記基本一致，由膠圖可見(jiàn)山茱萸和株木、四照花、葡萄、山楂產(chǎn)生的譜帶截然不同，說(shuō)明可以運(yùn)用ST