GX50對與皮膚衰老相關(guān)的NF-κB通路的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景:目前已有研究證明，尼古丁(即煙堿)可以通過激活α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7nicotin acetylcholine receptor，α7nAChR）來抑制核因子κB（nuclear transcriptionfator-kappa B，NF-κB）信號通路，從而預(yù)防老年癡呆癥。但尼古丁會使人上癮，重復(fù)使用尼古丁會加快心臟速度和升高血壓并降低食欲。大劑量的尼古丁會引起惡心嘔吐，嚴(yán)重時會致死。由于α7nAChR是尼古丁的主要

2、效應(yīng)部位，魏冬青教授針對尼古丁發(fā)揮作用的α7nAChR，采用生物信息學(xué)方法設(shè)計并篩選得到一種化合物GX50。GX50是花椒中的一種天然組分，使用安全。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，GX50對巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的NF-κB信號通路都具有調(diào)節(jié)作用，為了探究它對皮膚衰老的作用，我們以皮膚為模型，研究GX50對皮膚衰老及NF-κB信號通路的作用，為該化合物應(yīng)用于臨床做準(zhǔn)備。有文獻(xiàn)表明哺乳動物老化普遍與NF-κB有關(guān)，證明年老皮膚中NF-κ

3、B 被嚴(yán)重阻斷能逆轉(zhuǎn)許多老化特征。已證實(shí)人類和小鼠的許多組織中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 可能是與老化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化的活化劑。年齡性衰老小鼠皮膚的NF-κB基因被阻斷，能使整體基因表達(dá)程序逆轉(zhuǎn)到年輕時的狀態(tài)，在形態(tài)學(xué)上表型也會恢復(fù)到年輕時候的狀態(tài)。
　　 目的:探究GX50對皮膚衰老及NF-κB信號通路的作用，為該化合物應(yīng)用于臨床做準(zhǔn)備。
　　 方法:為了探究GX50在皮膚衰老中的作用，我們主要從組織水平和細(xì)胞水平兩方面進(jìn)行研究

4、。在組織水平上，進(jìn)行了涂藥實(shí)驗(yàn)，給老年小鼠背部皮膚左側(cè)涂抹溶于二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和甘油中的GX50，右側(cè)只涂DMSO和甘油做對照，兩周后剪取兩側(cè)皮膚制作冰凍切片。首先進(jìn)行HE 染色，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組皮膚的差別。為進(jìn)一步說明兩側(cè)皮膚的區(qū)別，我們選擇膠原蛋白抗體進(jìn)行免疫組化染色，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組膠原蛋白表達(dá)量。為了探究GX50促使皮膚年輕化的作用靶點(diǎn)是否也是NF-κB信號通路，對實(shí)驗(yàn)組和對照組皮

5、膚進(jìn)行了電泳遷移率分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）實(shí)驗(yàn)，通過測定NF-κB 入核量，來檢驗(yàn)NF-κB的活性。使用Western Blot的方法對皮膚組織漿蛋白進(jìn)行檢測，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是NF-κB信號通路中NF-κB的抑制因子I-κB 磷酸化的程度。在細(xì)胞水平上，進(jìn)行小鼠表皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)并選取廣譜角蛋白（PanCytokeratin，PCK）一抗進(jìn)行免疫熒光染色鑒定其純度。對細(xì)胞進(jìn)行G

6、X50、脂多糖（lipopolysacharide，LPS）和空白對照（Blank）處理，然后提取表皮細(xì)胞膜蛋白、核蛋白和漿蛋白，并在紫外分光光度計下對所提蛋白進(jìn)行濃度測定。藥物設(shè)計方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GX50能有效地激活α7nAChR，應(yīng)用Octet RED 生物相互作用分析儀，檢測GX50與表皮細(xì)胞膜α7nAChR的結(jié)合能力。通過EMSA 來檢測表皮細(xì)胞NF-κB的活性。通過Western Blot 來檢測IκB 磷酸化的程度。
　　

7、 結(jié)果（1）小鼠皮膚組織切片HE染色結(jié)果顯示：表皮部分，左側(cè)比右側(cè)平坦，基底層細(xì)胞大小、形態(tài)較規(guī)整，胞外基質(zhì)排列較緊密；真皮部分，左側(cè)比右側(cè)毛囊多而密，黑素細(xì)胞數(shù)目較多，黑色素沉積較少；表皮與真皮的交界處，左側(cè)皮膚交界比較明顯，表皮與真皮的連接比較牢固。（2）小鼠皮膚組織切片免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)左側(cè)比右側(cè)的膠原蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。（3）小鼠皮膚組織EMSA 結(jié)果顯示涂有GX50的皮膚組織中入核的NF-κB蛋白量比對照組有所降

8、低（P＜0.05），從而證實(shí)GX50對NF-κB的活化有一定的抑制作用。(4)小鼠皮膚組織Western Blot結(jié)果:顯示在實(shí)驗(yàn)組比對照組上樣量多的情況下，對照組有隱約的p-IκB的條帶，而涂有GX50的實(shí)驗(yàn)組沒有看到條帶。通過內(nèi)參校正，認(rèn)為GX50可能抑制了I-κB的磷酸化，從而阻遏了NF-κB的活化，使其對下游靶基因的調(diào)節(jié)減弱。（5）受體結(jié)合曲線趨勢說明GX50對皮膚調(diào)節(jié)作用的靶點(diǎn)可能就是α7nAChR。（6）EMSA 滯后帶灰度

9、分析說明表皮細(xì)胞GX50組NF-κB的入核量低于空白對照組（P＜0.05），說明GX50降低了NF-κB的活性。（7）結(jié)果顯示GX50組的細(xì)胞漿蛋白中的IκB 高于空白對照組（P＜0.05），而GX50組的細(xì)胞漿蛋白中的p-IκB 低于空白對照組（P＜0.05）。這個結(jié)果說明GX50抑制了IκB的磷酸化。
　　 結(jié)論:綜合細(xì)胞水平、組織水平上的實(shí)驗(yàn)，可以初步認(rèn)為GX50是通過α7nAChR 來調(diào)節(jié)與皮膚衰老相關(guān)的NF-κB通路，