遼河口及其毗鄰區(qū)域反硝化細(xì)菌的定量PCR方法的建立及分布研究.pdf

1、背景:近年來(lái)，由于遼河附近經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，各種工業(yè)廢物，生活廢水，以及農(nóng)業(yè)上使用的化肥等經(jīng)由遼河排入海中使水中的氮磷等元素的含量迅速增加，水體富營(yíng)養(yǎng)化嚴(yán)重，區(qū)域性生態(tài)環(huán)境惡化，對(duì)人類活動(dòng)產(chǎn)生了重大影響。硝化與反硝化作用在氮富集的河口區(qū)域起到重要的作用，硝化與反硝化作用一方面通過(guò)可以通過(guò)一步步反應(yīng)將無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)庖缘獨(dú)獾男问接谰玫某ピ摥h(huán)境中的氮，避免了因富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的赤潮;另一方面由于反硝化作用可以產(chǎn)生N2O其既是一種很強(qiáng)的溫室效應(yīng)氣體又

2、可以破壞臭氧層形成臭氧層空洞，因此從全球意義上來(lái)講研究硝化反硝化作用具有重要意義。由于反硝化細(xì)菌中含有反硝化功能基因，因此可以通過(guò)檢測(cè)反硝化基因的數(shù)目的方法來(lái)檢測(cè)反硝化細(xì)菌的數(shù)目。反硝化基因是一類功能基因，絕大部分反硝化細(xì)菌中含有反硝化基因，反硝化基因在細(xì)菌中的保守型很高，因此可以依據(jù)反硝化基因的保守性，設(shè)計(jì)合適的簡(jiǎn)并引物去擴(kuò)增基因。從而最終通過(guò)檢測(cè)反硝化基因的數(shù)目的方法檢測(cè)反硝化細(xì)菌的數(shù)目。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR的

3、方法檢測(cè)環(huán)境中硝化反硝化功能基因的濃度。首先以樣品為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到目的基因片段，之后對(duì)該基因片段進(jìn)行純化，連接到質(zhì)粒載體上，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，測(cè)定質(zhì)粒的濃度并計(jì)算其拷貝數(shù)，以此作為模板測(cè)定環(huán)境中功能基因的拷貝數(shù)。
　　結(jié)果:遼河口5月沉積物nirS濃度范圍為1.49×105-5.71×106copies/g,均值為1.89×106copies/g;8月沉積物nirS的基因濃度范圍為5.19×104-9.02×107copie

4、s/g均值2.72×107copies/g;遼河口5月水樣的nirS基因濃度范圍為3.94×105-3.19×107copies/L，均值為7.76×106copies/L;8月份水樣的基因濃度范圍為1.31×106-7.31×108copies/L，均值為2.14×108copies/L。對(duì)于沉積物和水樣中8月份nirS基因的濃度均值要大于5月份的基因濃度均值，并且8月大部分站位的nirS的基因濃度要高于5月份的基因濃度。對(duì)nirS的

5、站位濃度分布分析發(fā)現(xiàn)，其分布并沒(méi)有明顯的規(guī)律性，而是以一些站位存在極值的分布。遼河口5月沉積物nirK的濃度范圍為5.34×104-8.75×107copies/g，均值1.64×107copies/g;8月沉積物nirK濃度范圍為2.18×105-5.19×107copies/g均值8.79×106copies/g;遼河口5月水樣中nirK基因濃度范圍為7.71×105-2.54×108copies/L均值為2.35×107copie

6、s/L;8月份水樣nirK基因濃度范圍為9.28×105-9.39×108copies/L均值為1.44×108copies/L。8月份沉積物nirK基因濃度均值要小于5月份nirK，水樣中則正好相反。nirK也是存在極值的分布。遼河口5月沉積物nosZ基因濃度范圍為1.32×103-1.41×106copies/g均值2.83×105copies/g;8月份沉積物nosZ基因濃度范圍為1.06×104-7.55×105copies/g

7、,均值為2.33×105copies/g;遼河口5月份水樣的基因濃度范圍為3.22×103-4.92×105copies/L，均值為1.12×105copies/L;8月份水樣基因濃度范圍為3.86×106-2.19×106copies/L，均值為1.28×106copies/L。沉積物中8月份大多數(shù)站位nosZ基因的濃度要小于5月份nosZ基因的濃度，水樣中則剛好相反，nosZ基因濃度的站位分布也沒(méi)有明顯的分布規(guī)律。遼河口5月沉積物1

8、6S rRNA基因濃度范圍為8.71×103-3.31×108copies/g均值為4.47×107copies/g;8月份沉積物16S rRNA基因濃度范圍為8.46×105-8.48×108copies/g,均值為1.07×108copies/g;遼河口5月份水樣基因濃度范圍為2.24×105-4.21×107copies/g均值為6.77×106copies/L;8月份水樣濃度范圍為2.24×105-1.88×1010copies

9、/L均值為1.99×109copies/L。沉積物和水樣中8月基因的濃度均值和大部分站位都大于5月份基因的16S rRNA基因的濃度。
　　結(jié)論:對(duì)于nirS和16S rRNA，沉積物和水樣中8月份基因的濃度都要高于5月份，這提示有可能是溫度和硝酸鹽濃度的升高從而導(dǎo)致的。對(duì)于nirK和nosZ結(jié)果則不同，甚至水樣和沉積物的規(guī)律也不一樣，這提示不同基因以及不同介質(zhì)對(duì)時(shí)間變化的反應(yīng)是不一樣的。四種基因分布并不呈現(xiàn)由河流河口到遠(yuǎn)海逐漸降