豬細(xì)小病毒2型間接ELISA與間接免疫熒光檢測(cè)方法的建立及血清流行病學(xué)初步調(diào)查.pdf

1、豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)引起的在母豬特別是初產(chǎn)母豬中不孕、流產(chǎn)，死胎、木乃伊胎等繁殖障礙綜合性疾病。該病在全球范圍內(nèi)廣泛存在，間接或直接造成了養(yǎng)豬業(yè)重大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)PPV出現(xiàn)了很多新的變異株。其中，豬細(xì)小病毒2型(Porcine parvovirus，PPV2)是2001年在緬甸豬戊型肝炎(HEV)研究過(guò)程中新發(fā)現(xiàn)的細(xì)小病毒科的成員，與傳統(tǒng)的豬細(xì)小病毒（豬細(xì)小病毒1型）親

2、緣性較遠(yuǎn)。迄今為止，只在緬甸和中國(guó)有相關(guān)報(bào)道。我們?cè)谶M(jìn)行浙江省爆發(fā)的豬高熱病相關(guān)研究中，分離到了PPV2，針對(duì)該病毒進(jìn)行了一系列的研究。為了加強(qiáng)對(duì)該病的疫情監(jiān)測(cè)和血清流行病學(xué)調(diào)查，有必要研發(fā)出一種在特異性和敏感性均較高的血清學(xué)檢測(cè)方法。
　　 本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了PPV2 VP2蛋白，在本實(shí)驗(yàn)室孫宗英的基礎(chǔ)上探索性復(fù)核了間接ELISA檢測(cè)方法:將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，而后通過(guò)提取包涵體

3、，His親和層析法純化，透析法復(fù)性。將該重組蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，以PCR陽(yáng)性混合血清作為陽(yáng)性血清及某豬場(chǎng)未吃初乳的新生仔豬陰性血清作為一抗血清，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗豬IgG作為二抗，建立了針對(duì)PPV2 VP2抗體的間接ELISA。在方法復(fù)核過(guò)程中，對(duì)該間接ELISA各種反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整，確定了最適工作條件。最后，重復(fù)性試驗(yàn)（批內(nèi)，批間），敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法是可靠的。同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室徐雅萍建立的PPV2-ORF

4、2重組腺病毒，對(duì)PPV2ORF2進(jìn)行了真核表達(dá)，建立了針對(duì)PPV2ORF2間接免疫熒光檢測(cè)方法。在試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)IFA使用的細(xì)胞系，接毒時(shí)間，固定液及固定時(shí)間，一抗反應(yīng)濃度及反應(yīng)時(shí)間，二抗FITC反應(yīng)濃度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了摸索，最后對(duì)建立好的方法的特異性，敏感性及重復(fù)性進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該檢測(cè)方法可靠。
　　 使用建立好的間接ELISA和間接免疫熒光方法對(duì)采集自華東地區(qū)的357份豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間接ELISA方法檢