豬骨骼肌差異表達(dá)基因CMYA1及其同一家族成員CMYA4和CMYA5的克隆、定位與功能研究.pdf

1、我國豬育種的目標(biāo)集中在生長、胴體、肉質(zhì)、繁殖和抗病性狀的改良上，豬肉產(chǎn)品的數(shù)量和質(zhì)量的提高一直是豬育種工作的重點(diǎn)。中國地方品種與西方引入品種在生長速度、胴體瘦肉率、肌肉品質(zhì)等性狀上存在較大差異，這種表型上的差異應(yīng)是由遺傳差異所造成的。為了揭示造成這種差異的分子遺傳機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期利用mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display, DD)篩選存在于中外兩個(gè)代表品種一二花臉與杜洛克成年豬背最長肌組織中差異表達(dá)E

2、ST，發(fā)現(xiàn)其中一條新EST在杜洛克中的表達(dá)量明顯高于二花臉。本研究利用該EST信息，通過生物信息學(xué)方法分析該EST對(duì)應(yīng)于人CMYA1(Cardiomyopathy associated1)基因。CMYA1基因隸屬CMYA基因家族，該家族共有5個(gè)成員。本論文選取其中3個(gè)基因(CMYA1、CMYA4和CMYA5)，開展了豬新基因的克隆、定位及其功能的初步研究，得到如下結(jié)果：
　　 1、以mRNA差異表達(dá)EST為基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)、

3、比較基因組學(xué)以及RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)，利用RT-PCR實(shí)驗(yàn)分離、克隆、驗(yàn)證并獲得了豬CMYA1基因完整的cDNA序列以及基因組DNA序列；獲得了豬CMYA4基因包含完整編碼區(qū)序列的部分cDNA序列；獲得了豬CMYA5基因部分cDNA序列。
　　 2、利用ORF finder軟件推導(dǎo)了豬CMYA1、CMYA4和CMYA5基因的氨基酸序列，并利用MotifScan軟件預(yù)測(cè)了

4、它們的結(jié)構(gòu)域與功能。其中，豬CMYA1基因含有位于氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，羧基端的SH3結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及16個(gè)氨基酸的重復(fù)序列。
　　 3、利用RH(radiation hybrid)克隆板對(duì)豬CMYA1、CMYA4和CMYA5基因進(jìn)行了染色體定位，結(jié)果表明CMYA1基因定位于SSC13q，與Sw344緊密連鎖(LOD值為10.19); CMYA4基因定位于SSC12，與Sw62緊密連鎖(LOD值為18.07);CMYA5基因定

5、位于SSC2q21-24，與Sw1602緊密連鎖（LOD值為6.74）。
　　 4、利用RT-PCR方法檢測(cè)了CMYA1、CMYA4和CMYA5三個(gè)基因在長白豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、骨骼肌、小腸、胃及脂肪組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示這3個(gè)基因都只在心肌和骨骼肌中特異表達(dá)。
　　 5、運(yùn)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR，分析了CMYA1基因在通城和長白不同發(fā)育時(shí)期（胚胎33天，65天，90天）骨胳肌的表達(dá)情況。結(jié)果顯示CMYA1

6、基因在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期呈上調(diào)表達(dá)模式，在33天左右表達(dá)量很低，在隨后65天至90天左右表達(dá)量逐漸升高。該基因在長白3個(gè)時(shí)期的表達(dá)量都明顯高于通城豬。在胚胎發(fā)育的65天和90天，該基因的表達(dá)量在兩品種中均存在顯著差異(P＜0.05)。
　　 6、對(duì)CMYA1、CMYA4和CMYA5三個(gè)基因進(jìn)行了SNP掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1)CMYA1編碼區(qū)中存在6個(gè)SNPs(C1053T、A1275G、A1394G、A1751G、

7、C3171T和C3290A)，其中3個(gè)位點(diǎn)(A1394G、A1751G和C3290A)堿基突變引起氨基酸的改變（分別為精氨酸-組氨酸、天冬氨酸-甘氨酸和蘇氨酸-天冬氨酸）；
　　 2)CMYA4基因第15內(nèi)含子A558G突變
　　 3)CMYA5基因編碼區(qū)A7189C突變，該突變引起氨基酸由異亮氨酸變成亮氨酸。
　　 7、利用PCR-RFLP方法分別檢測(cè)了CMYA1、CMYA4和CMYA5三個(gè)基因共計(jì)8個(gè)SNPs

8、在杜洛克、大白、長白、通城、清平、江西玉山黑、大花白、二花臉和小梅山等中外9個(gè)品種中的基因型分布，同時(shí)進(jìn)行了遺傳學(xué)分析?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果表明，這8個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型頻率在不同品種間存在不同程度的差異。
　　 8、在我室與通城縣畜牧局合作組建的試驗(yàn)豬群中，利用PCR-RFLP方法檢測(cè)上述8個(gè)SNP的基因型，采用SAS（視窗V8版）GLM(General Linear Models)程序?qū)ζ渲?個(gè)SNPs位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行了初步的關(guān)

9、聯(lián)分析。結(jié)果顯示，CMYA1基因編碼區(qū)HinfI-RFLP(C1053T)位點(diǎn)與6-7肋骨間背膘厚以及最后肋骨處背膘厚存在顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05);Bsp143Ⅱ-RFLP(A1275G)與第10肋骨背膘厚以及肌內(nèi)脂肪含量存在顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05);HaeⅢ-RFLP(A1751G)與平均背膘厚以及最后肋骨處背膘厚存在顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)；RsaI-RFLP(C3290A)與平均背膘厚存在顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05);CMYA4基因M

10、spI-RFLP(A558G)與6-7肋間膘厚以及肩膘存在顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)；CMYA5基因BspTI-RFLP(A7189C)與腿臀比率存在顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)。結(jié)果表明3個(gè)新基因是影響肌肉產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的候選基因。
　　 9、利用CMYA1基因編碼區(qū)HaeⅢ-RFLP(A1751G)位點(diǎn)，在美國Max.F Rothchild教授及其同事用2頭巴克夏公豬與9頭大自母豬交配產(chǎn)生525頭F2代資源群體中檢測(cè)了豬CMYA1