慢性乙型肝炎肝纖維化血清多肽組學(xué)和組織基因芯片的診斷研究.pdf

1、第一章血清多肽組學(xué)研究:慢性乙型肝炎患者肝纖維化診斷新標(biāo)志物-二羥基丙酮酸激酶肽片段
　　目的:在慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者中應(yīng)用血清多肽組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)和評(píng)價(jià)新的非創(chuàng)傷性診斷肝纖維化的標(biāo)志物。
　　方法:第一階段應(yīng)用多肽組學(xué)多肽表達(dá)譜技術(shù)分析40例慢性乙型肝炎(CHB)病例的血清標(biāo)本（20例輕度纖維化組，20例重度纖維化組）。液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)用于分離和篩選顯著差異表達(dá)多肽峰。第二階段應(yīng)用多種反

2、應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)技術(shù)分析另一組隊(duì)列包括20例健康對(duì)照組和86例CHB病例組（不同肝纖維化階段）的血清標(biāo)本。MRM用于定量檢測(cè)顯著差異表達(dá)多肽分離的離子峰面積與內(nèi)參離子峰面積比值(SPAR)。第三階段血清肽片段診斷模型建立和AUROC評(píng)估，有效的血清肽片段標(biāo)志物的生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:通過LC-MS/MS檢測(cè)出21個(gè)顯著差異表達(dá)的多肽峰。MRM定量檢測(cè)僅能識(shí)別5個(gè)差異多肽峰分離的12個(gè)離子對(duì)。M/z520.3多肽峰分離的4個(gè)離

3、子對(duì)（520.3/176.1，520.3/353.7，520.3/459.8和520.3/503.3）的SPAR值表現(xiàn)為隨著纖維化程度加重（無纖維化Scheuer0期至肝硬化Scheuer4期）而逐漸減少。由離子對(duì)520.3/176.1，520.3/353.7，520.3/503.3和4個(gè)離子對(duì)結(jié)合所建立的診斷模型，區(qū)分S2-S4期與S0-S1期的AUROC值達(dá)到0.903～0.967和區(qū)分S3-S4期與S0-S2期的AUROC值達(dá)到0

4、.917～0.967。離子對(duì)520.3/176.1，520.3/353.7，520.3/459.8，520.3/503.3建立的診斷模型，區(qū)分S0-S4期纖維化患者與健康人群的AUROC值接近1.0。這些模型的診斷敏感性和特異性優(yōu)于天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶比血小板比值指數(shù)（APRI），F(xiàn)IB-4和Forn's指數(shù)。生物信息學(xué)分析m/z520.3多肽峰是來源于二羥基丙酮酸激酶的肽片段。
　　結(jié)論:采用血清多肽組學(xué)技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證了血清二羥

5、丙酮酸激酶的肽片段（m/z520.3多肽峰）是一新的有前景的非創(chuàng)傷性診斷肝纖維化的標(biāo)志物。
　　第二章組織基因芯片研究:慢性乙型肝炎病毒肝纖維化與肝腫瘤發(fā)生的基因組表達(dá)譜風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)
　　目的:采用基因微陣列分析，了解乙型肝炎病毒肝纖維化和肝腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)mRNA基因表達(dá)譜。
　　方法:采用人Affymetrix基因芯片檢測(cè)161例臨床隊(duì)列的肝組織基因表達(dá)譜學(xué)。采用GeneSpringGX軟件分析顯著差異基因，基因功能

6、和信號(hào)通路;微陣列顯著分析(SAM)和微陣列預(yù)測(cè)分析(PAM)篩選肝纖維化和腫瘤相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)基因。
　　結(jié)果:研究建立161例臨床隊(duì)列，包括正常對(duì)照組(n=7)，肝纖維化組(n=139;S0-S4亞組:n=48，23，37，17，14)和肝細(xì)胞肝癌組(n=15)。差異基因聚類圖顯示基因表達(dá)譜和病理學(xué)肝纖維化分期具有很好的相關(guān)性。將S1-S4組分別和S0組比較，共篩選出1451個(gè)顯著差異基因(P=5×10-6)。在S4組和S0組之間有1

7、74個(gè)上調(diào)2倍以上的基因，主要是3大類功能基因（結(jié)構(gòu)分子活性基因占26.7％，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因占12.0％和細(xì)胞粘附基因占11.1％）。生物信息學(xué)分析確認(rèn)Jak-STAT和趨化因子信號(hào)通路是肝纖維化信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的核心通路。SAM和PAM評(píng)估“肝纖維化風(fēng)險(xiǎn)基因”和“肝腫瘤風(fēng)險(xiǎn)基因”，確認(rèn)了一組基因(n=37)具慢性乙型肝炎關(guān)聯(lián)的肝纖維化進(jìn)展或肝腫瘤發(fā)生的“高風(fēng)險(xiǎn)”特征。
　　結(jié)論:通過基因芯片研究，我們確立了一組差異基因和信號(hào)通路可有效