乙型肝炎代謝組學(xué)研究及加壓毛細(xì)管電色譜質(zhì)譜聯(lián)用平臺(tái)的搭建.pdf

1、目前，全世界總共有超過3.7億例感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的患者,乙型肝炎病毒的攜帶者在中國大約有1.2億例,而發(fā)展為肝硬化患者的比例約占全球肝硬化患者的1/3。乙型肝炎感染是肝硬化和肝癌的主要誘發(fā)因素之一，HBV基因具有高度變異性，臨床上采用核苷類藥物及干擾素進(jìn)行治療，但對(duì)部分HBV患者療效欠佳。因此可靠無創(chuàng)的快速篩查技術(shù)，對(duì)于輔助乙肝患者病情判斷，監(jiān)測(cè)藥物療效和預(yù)后判斷是非常必要的。我們可通過代謝

2、組學(xué)的研究手段更好的了解乙型肝炎病變的過程以及與疾病相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)的代謝途徑，從而發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，進(jìn)一步輔助臨床診斷。
　　在本研究中主要采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography time-of-flight mass spectrometer GC-TOFMS）和超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography quadr

3、upole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOFMS）兩類分析平臺(tái)對(duì)乙型肝炎患者和健康對(duì)照者的血清樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，希望尋找到與疾病有密切聯(lián)系的潛在的生物標(biāo)志物。篩選過程主要通過多維模式識(shí)別分析（主成分分析 PCA和正交偏最小二乘法 OPLS-DA）和單維統(tǒng)計(jì)分析等算法，最終篩選出23個(gè)差異代謝物，進(jìn)一步我們對(duì)所篩選的所有差異物分別做受試者工作特征曲線（ROC曲線），選取曲線下面積比

4、較大的物質(zhì)擬合成綜合變量，再做ROC曲線，最終選定膽堿、丙二酸、纈氨酸三者擬合綜合變量，曲線下面積（AUC）可達(dá)0.996，故這三個(gè)物質(zhì)作為生物標(biāo)志物在診斷時(shí)具有很高靈敏度和特異度。
　　加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC）與質(zhì)譜聯(lián)用研究非常少。pCEC的流速一般為一分鐘幾百納升級(jí)，而質(zhì)譜納噴離子源的流速也為幾到幾百納升每分鐘的范圍，pCEC與納噴源的結(jié)合具有天然的優(yōu)勢(shì)。如果將pCEC的高柱效、高選擇性、高分辨率以及快速分離的特點(diǎn)同納噴源

5、質(zhì)譜的高靈敏度以及可以提供精確分子量和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)相結(jié)合，可以成為復(fù)雜體系樣品定性、定量強(qiáng)有力的分析工具。而且pCEC進(jìn)樣量為納升級(jí)，這對(duì)于極其珍貴的生物樣本的檢測(cè)是高度契合的，如果將pCEC與納噴源質(zhì)譜聯(lián)用的平臺(tái)運(yùn)用到代謝組學(xué)研究中，必將極大的推動(dòng)代謝組學(xué)的發(fā)展。在本研究中初次搭建了pCEC-nano-tripleTOFMS的平臺(tái)，填補(bǔ)了這一領(lǐng)域的空白。
　　本論文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)部分：
　　1.建立了基于N,O-

6、雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生的氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC-TOFMS）的分析技術(shù)方法，探討了正常人和乙型肝炎患者的血清代謝譜圖差異。利用多維統(tǒng)計(jì)的PCA和OPLS-DA來觀察乙型肝炎患者和健康者的代謝差異，接著使用了200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)來避免判別模型的過擬合。利用VIP值從建立的七重交互驗(yàn)證的OPLS-DA模型中進(jìn)行差異物的選擇，我們從檢測(cè)到的518個(gè)物質(zhì)中選取了247個(gè)VIP大于1的差異物。進(jìn)一步對(duì)其做單維統(tǒng)計(jì)T檢

7、驗(yàn)分析，以及倍數(shù)變化分析等多種運(yùn)算，最終確定了10個(gè)重要的差異性代謝物,并利用KEGG等在線數(shù)據(jù)庫以及大量的文獻(xiàn)調(diào)研對(duì)其代謝通路進(jìn)行闡釋。其中檸檬酸、烏頭酸、谷氨酰胺、二甲甘氨酸和丙二酸與乙型肝炎患者組的相關(guān)性較好，對(duì)其擬合的綜合變量做ROC曲線，AUC達(dá)到0.975，大于0.9，故這5個(gè)物質(zhì)作為生物標(biāo)志物在診斷時(shí)具有很高靈敏度和特異度。
　　2.分別采用UPLC-QTOFMS正離子模式和負(fù)離子模式對(duì)乙型肝炎患者和健康者進(jìn)行了血清

8、代謝組學(xué)的研究。利用多維統(tǒng)計(jì)分析（PCA，OPLS-DA）和單維統(tǒng)計(jì)分析分別對(duì)兩套數(shù)據(jù)進(jìn)行差異代謝物的篩選，最終從正離子模式檢測(cè)到的4762個(gè)物質(zhì)中找到了67個(gè)差異物，從負(fù)離子模式檢測(cè)到的3704個(gè)物質(zhì)中找到了61個(gè)差異物。進(jìn)一步對(duì)其做倍數(shù)變化分析等多種運(yùn)算找到13個(gè)重要的代謝差異物（其中8個(gè)來自正離子模式，5個(gè)來自負(fù)離子模式），涉及膽汁酸代謝、氨基酸代謝、膽堿代謝、花生四烯酸的代謝等。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)甘氨鵝去氧膽酸、纈氨酸、膽堿三個(gè)代謝物擬合

9、的綜合變量與HBV患者組的相關(guān)性較好，AUC可達(dá)0.953，可以看出這3個(gè)代謝物具有比較強(qiáng)的特異度和敏感度。
　　3.整合 UPLC-QTOFMS和GC-TOFMS檢測(cè)到的所有差異代謝物，將兩個(gè)平臺(tái)分別擬合的綜合變量重新擬合成新變量PRE3，然后對(duì)其做ROC曲線用來區(qū)分患者組與健康組，結(jié)果實(shí)現(xiàn)了AUC=1，具有很強(qiáng)的診斷率，進(jìn)一步我們只利用了膽堿、丙二酸、纈氨酸三個(gè)物質(zhì)進(jìn)行擬合做ROC曲線，AUC即可達(dá)到0.996，說明這3個(gè)物質(zhì)

10、具有很高的診斷準(zhǔn)確性，便于乙型肝炎的病情監(jiān)測(cè)及治療效果的監(jiān)測(cè)。
　　4.利用無死體積二通和電隔離槽成功地搭建了pCEC與Nano源TripleTOFMS連接的平臺(tái)，成功的解決了pCEC與質(zhì)譜連接時(shí)加電的技術(shù)難題，同時(shí)利血平檢測(cè)的靈敏度可達(dá)5 pg（信噪比大于300）,證明本平臺(tái)具有很好的檢測(cè)靈敏度。
　　本論文的內(nèi)容覆蓋了不同分析平臺(tái)的乙型肝炎代謝組學(xué)應(yīng)用研究，為將來全面理解乙型肝炎的病理機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和一個(gè)新的視角。同