DMOG穩(wěn)定缺血-再灌注心肌組織HIF-1α表達(dá)的時(shí)間規(guī)律及對(duì)線粒體功能的影響.pdf

1、血流再灌注是治療心肌缺血的首選策略，然而由此帶來的再灌注損傷是造成心梗面積增加、心肌細(xì)胞丟失的重要原因。近年的研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理、缺血后處理等機(jī)械性調(diào)控措施對(duì)心肌缺血/再灌注（Ischemic/reperfusion，I/R）損傷具有保護(hù)作用，并且是通過上調(diào)HIF-1（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1）表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。HIF-1是一種對(duì)氧敏感的核轉(zhuǎn)錄因子，由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，其活性主要取決于α亞基。在缺血

2、缺氧狀態(tài)下，HIF-1α能夠調(diào)控下游200多種促細(xì)胞生存基因的轉(zhuǎn)錄激活；而在常氧狀態(tài)下，HIF-1α在胞漿中易被脯氨酸羥化酶（Proline Hydroxylase，PHD）羥化修飾，經(jīng)泛素化途徑降解失活，所以在再灌注時(shí)期HIF-1α難以發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)效應(yīng)。因此，研究人員多采用PHD抑制劑二甲基乙二酰基甘氨酸（Dimethyloxalyglycine，DMOG）穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)，使HIF-1α對(duì)心肌的保護(hù)效應(yīng)得以持續(xù)，然而這種方法

3、穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)的時(shí)間規(guī)律如何，是決定急性實(shí)驗(yàn)中取材時(shí)間點(diǎn)選擇的關(guān)鍵因素，但目前未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究的第一部分?jǐn)M從整體動(dòng)物水平，結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)手段，觀察DMOG預(yù)處理對(duì)I/R心肌組織中HIF-1α表達(dá)量影響的時(shí)間規(guī)律，為后續(xù)HIF-1α的功能研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　大量研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙是導(dǎo)致心肌I/R損傷、誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的一種重要病理機(jī)制，包括線粒體ROS爆發(fā)性產(chǎn)生、鈣離子超載、線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換

4、孔（mPTP）持續(xù)開放等。mPTP開放可使線粒體基質(zhì)中促凋亡因子與細(xì)胞色素C（Cyt c）釋放，進(jìn)而激活Caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；同時(shí)線粒體基質(zhì)水腫，外膜破裂，線粒體膜電位被破壞，加速能量耗竭。因此，保護(hù)線粒體功能已成為改善心肌I/R損傷的關(guān)鍵。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)可通過抑制線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡而發(fā)揮對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用，然而HIF-1α的心肌保護(hù)效應(yīng)是否與改善線粒體功能障礙有關(guān)，目前尚不

5、清楚。因此，本研究的第二部分?jǐn)M在第一部分實(shí)驗(yàn)確定DMOG穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)最佳時(shí)間點(diǎn)的基礎(chǔ)上，觀察HIF-1α對(duì)心肌I/R線粒體功能的影響，為HIF-1α心肌保護(hù)機(jī)制的闡明提供新的思路。
　　第一部分 DMOG穩(wěn)定缺血/再灌注心肌組織HIF-1α表達(dá)的時(shí)間規(guī)律
　　目的：
　　觀察DMOG預(yù)處理對(duì)大鼠I/R心肌組織中HIF-1α表達(dá)量影響的時(shí)間規(guī)律，為后續(xù)HIF-1α功能研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　

6、　選取8周齡，220~260g雄性Wistar大鼠78只，隨機(jī)分為4組：Sham，MI/R， D+MI/R，YC-1+MI/R（YC-1為HIF-1α抑制劑）。水合氯醛麻醉大鼠，心電監(jiān)測(cè)，打開胸腔行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)（Ligation of the left anterior descending coronary artery, LAD），心肌缺血45min，再灌注0h，3h，6h，9h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)。留取心臟左室前壁標(biāo)本，分別采用R

7、eal-time PCR和Western blot方法檢測(cè)心肌組織中HIF-1αmRNA與蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　Western blot結(jié)果顯示：隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，Sham組在再灌注不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異且保持在較低水平（1±0.11）；而MI/R組在再灌注0h時(shí)表達(dá)量最高（1.55±0.17），隨后逐漸降低；D+MI/R組的HIF-1α蛋白表達(dá)量則表現(xiàn)為先增高、后降低趨勢(shì)，再灌注3h時(shí)達(dá)峰

8、值（2.88±0.21，P<0.05）；YC-1+MI/R組與Sham組類似，在再灌注不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異且保持在較低水平（0.03±0.01）。
　　與MI/R組相比，D+MI/R組在再灌注同一時(shí)間點(diǎn)HIF-1α蛋白表達(dá)量明顯增加，各時(shí)間點(diǎn)的增加倍數(shù)分別為：0h，1.35倍（P<0.05）；3h，3.9倍；6h，7.7倍；9h，5.0倍（3h，6h，9h均P<0.01）。YC-1+MI/R組與MI/R組相比

9、，HIF-1α蛋白表達(dá)量在再灌注0h、3h時(shí)間點(diǎn)明顯降低（P<0.05），6h、9h兩組之間并無(wú)明顯差異（P?0.05）。
　　Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：Sham組，MI/R組，D+MI/R組，YC-1+MI/R組在再灌注各時(shí)間點(diǎn)的HIF-1αmRNA表達(dá)量均無(wú)明顯差異（P?0.05）；且組間相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行多重比較也無(wú)明顯差異（P?0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. DMOG預(yù)處理能夠穩(wěn)定心肌I/R時(shí)HI

10、F-1α的蛋白表達(dá)，在再灌注3h時(shí)表達(dá)量達(dá)峰值；
　　2. DMOG預(yù)處理對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響主要發(fā)生在蛋白合成水平，而非基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　第二部分穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)對(duì)缺血/再灌注心肌組織線粒體功能的影響
　　目的：
　　觀察穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)對(duì)I/R心肌組織線粒體功能的影響，探討HIF-1α發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)的可能機(jī)制。
　　方法：
　　選取220~260g成年雄性Wistar大鼠24只，隨

11、機(jī)分為4組：Sham，MI/R，D+MI/R， YC-1+MI/R。水合氯醛麻醉大鼠，心電監(jiān)測(cè)，打開胸腔，行LAD，心肌缺血45min，再灌注3h后處死動(dòng)物，留取大鼠心臟左室前壁心肌組織標(biāo)本，提取心肌組織中的線粒體，JC-1染色法測(cè)定線粒體膜電位，ELISA法檢測(cè)胞漿和線粒體中細(xì)胞色素C的含量。
　　結(jié)果：
　　熒光顯微鏡下觀察可見：Sham組紅色熒光強(qiáng)度明顯高于綠色熒光，表明該組心肌細(xì)胞中線粒體膜電位較高；與Sham組相比

12、，MI/R組紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱，綠色熒光強(qiáng)度增加，表明線粒體基質(zhì)中聚合體形式的JC-1較少，線粒體膜電位下降；與MI/R組相比，D+MI/R組紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，綠色熒光強(qiáng)度減弱；而YC-1+MI/R組的綠色熒光強(qiáng)于紅色熒光，說明線粒體膜電位最低。
　　比較各組的紅色/綠色熒光強(qiáng)度值（R/G RFU）：與Sham組相比，MI/R組的R/G RFU較低（4.497±0.189 vs.9.840±0.325，P<0.01）；而D+

13、MI/R組則較MI/R組的R/G RFU明顯增加（7.908±0.538 vs.4.497±0.189，P<0.01）；YC-1+MI/R組的R/G RFU值卻明顯低于MI/R組（P<0.01）。
　　當(dāng)線粒體mPTP開放時(shí)，線粒體中的Cyt c可釋放入胞漿，導(dǎo)致線粒體與胞漿的Cyt c比值（mito-Cyt c/cyt-Cyt c）降低，因此檢測(cè)mito-Cyt c/cyt-Cyt c可反映mPTP的開放狀態(tài)以及線粒體功能是否受

14、損。本實(shí)驗(yàn)中mito-Cyt c/cyt-Cyt c測(cè)定結(jié)果顯示：MI/R組較Sham組比值降低了73％（P<0.01）；而DMOG則部分逆轉(zhuǎn)了MI/R所致的mito-Cyt c/cyt-Cyt c值降低，D+MI/R組為MI/R組的2.4倍（P<0.01）；YC-1+MI/R組的該值卻明顯低于MI/R組（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　穩(wěn)定HIF-1α表達(dá)可明顯抑制心肌I/R所致的線粒體膜電位降低，并減少線粒體Cyt c