赤擬谷盜RNAi及dsRNA脫靶效應(yīng)的研究.pdf

1、基因干擾(RNAi)是現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，該機(jī)制在不同進(jìn)化地位的物種中高度保守。在昆蟲(chóng)學(xué)領(lǐng)域中，RNAi技術(shù)不僅為昆蟲(chóng)的功能基因組研究提供了便捷的方法，也為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的防治提供了新途徑。然而，脫靶效應(yīng)(off target effect)給RNAi技術(shù)蒙上了陰影，是目前RNAi技術(shù)應(yīng)用的最大障礙。嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致應(yīng)用RNAi進(jìn)行昆蟲(chóng)功能基因組學(xué)研究產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)論，如果利用RNAi進(jìn)行害蟲(chóng)防治出現(xiàn)脫靶效應(yīng)，就會(huì)因?yàn)榘袠?biāo)的非特異性

2、而出現(xiàn)嚴(yán)重的環(huán)境安全性問(wèn)題，甚至影響人類(lèi)健康。因此，在應(yīng)用RNAi進(jìn)行害蟲(chóng)防控的研究中，昆蟲(chóng)體內(nèi)脫靶效應(yīng)的評(píng)估和控制是一個(gè)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題。本文以赤擬谷盜Triboliumcastaneum為研究對(duì)象，通過(guò)選擇合適的RNAi物質(zhì)，利用微陣列芯片研究RNAi過(guò)程中脫靶效應(yīng)的發(fā)生并探討可能存在的原因，同時(shí)評(píng)估了dsRNA脫靶效應(yīng)預(yù)測(cè)軟件“dsCheck”的準(zhǔn)確性，然后研究了與序列相關(guān)脫靶效應(yīng)相關(guān)的dsRNA分子特征，驗(yàn)證了RNAi過(guò)程中非

3、序列特異性脫靶效應(yīng)的存在。相關(guān)的研究成果可以為未來(lái)dsRNA的設(shè)計(jì)以及安全控制提供理論依據(jù)，促進(jìn)RNAi技術(shù)的實(shí)踐應(yīng)用。
　　1.赤擬谷盜中SiRNA與dsRNA引發(fā)的RNAi效應(yīng)比較
　　siRNA與dsRNA都被廣泛地應(yīng)用于沉默靶標(biāo)基因，但實(shí)踐發(fā)現(xiàn)在昆蟲(chóng)活體中siRNA很難引發(fā)RNAi的表型變化。為了證實(shí)這一現(xiàn)象同時(shí)選擇合適的昆蟲(chóng)RNAi方法，本研究選擇赤擬谷盜為研究對(duì)象，來(lái)比較siRNA與dsRNA的干擾效率。實(shí)驗(yàn)利用

4、4個(gè)dsRNA和10個(gè)siRNA靶向3個(gè)不同基因，分別測(cè)試了這些干擾RNA對(duì)靶標(biāo)基因的抑制效率以及導(dǎo)致試蟲(chóng)的畸形率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射不同dsRNA均可以有效抑制目標(biāo)基因的表達(dá)量(55-75％)，且能持續(xù)抑制超過(guò)7天，并導(dǎo)致78.8-87.0％的試蟲(chóng)畸形。但是注射不同的siRNA，多數(shù)對(duì)靶基因的表達(dá)沒(méi)有顯著的抑制作用，10個(gè)siRNA只有1個(gè)沉默了45％的靶標(biāo)基因表達(dá)量，抑制持續(xù)了僅3天，所有siRNA處理均未能引發(fā)試蟲(chóng)產(chǎn)生表型變化（畸形）。

5、上述結(jié)果表明，siRNA明顯比相應(yīng)的dsRNA干擾效率低，而且大部分不能引起表型變化。此外，siRNA的干擾效率隨其分子不同，或靶向位置而有很大變化，因此應(yīng)用siRNA需要仔細(xì)篩選。
　　2.赤擬谷盜中dsRNA引起的脫靶效應(yīng)
　　利用轉(zhuǎn)基因作物或工程生物表達(dá)dsRNA進(jìn)行害蟲(chóng)防治具有較好的前景，但目前對(duì)昆蟲(chóng)dsRNA脫靶效應(yīng)的研究較少，很難進(jìn)行生物安全控制。本實(shí)驗(yàn)利用赤擬谷盜RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)定制的微陣列芯片，通過(guò)檢測(cè)沉默

6、TcChi1之后赤擬谷盜體內(nèi)各種基因的表達(dá)情況，對(duì)dsRNA的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)靶向TcChil基因的不同 dsRNA處理赤擬谷盜后，分別導(dǎo)致了217和225個(gè)基因產(chǎn)生顯著的表達(dá)量變化（2倍以上，且差異顯著），其中分別有141和151個(gè)基因顯著下調(diào)。這些基因的功能多樣，大都與代謝過(guò)程、外界刺激以及生物學(xué)調(diào)節(jié)相關(guān)。通過(guò)生物信息學(xué)的方法，依據(jù)序列匹配度鑒定脫靶基因發(fā)現(xiàn)在赤擬谷盜中利用dsRNA進(jìn)行RNAi，不存在已報(bào)道的siR

7、NA種子區(qū)脫靶效應(yīng)，只是當(dāng)基因序列中具有一段長(zhǎng)度在19nt以上，且與dsRNA匹配約90％的序列片段時(shí)，其脫靶概率顯著高于其他基因。此外，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因與RNAi的免疫副反應(yīng)有關(guān)，推測(cè)RNAi可能產(chǎn)生非序列特異性免疫反應(yīng)。由此認(rèn)為，利用dsRNA進(jìn)行赤擬谷盜RNAi，可以通過(guò)不同途徑引起不同基因產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，其中與dsRNA具有高度相似性的同源基因，脫靶概率明顯高于其他基因。該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)dsRNA的設(shè)計(jì)以及加深對(duì)dsRNA引發(fā)脫靶效

8、應(yīng)的認(rèn)識(shí)具有重要意義。
　　3.預(yù)測(cè)軟件dsCheck對(duì)dsRNA脫靶效應(yīng)的預(yù)測(cè)
　　為了提高RNAi的專(zhuān)一性以及預(yù)測(cè)脫靶效應(yīng)的發(fā)生，生物信息學(xué)家根據(jù)已知RNAi脫靶效應(yīng)的原理，設(shè)計(jì)出了不同算法用于預(yù)測(cè)脫靶效應(yīng)，其中dsCheck是專(zhuān)門(mén)預(yù)測(cè)dsRNA脫靶效應(yīng)的軟件。本研究利用該軟件對(duì)第三章中所使用的兩個(gè)dsRNA的脫靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并與實(shí)際微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，以期驗(yàn)證該軟件的預(yù)測(cè)效果，探索可能的改進(jìn)途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在赤擬

9、谷盜中dsCheck軟件預(yù)測(cè)dsChi1和dsChi2分別會(huì)導(dǎo)致691個(gè)和519個(gè)基因脫靶，與微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其中分別只有10個(gè)和14個(gè)基因的表達(dá)受抑制。分析發(fā)現(xiàn)dsCheck軟件的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，隨理論生成的siRNA與預(yù)測(cè)脫靶基因的序列相似性降低而急劇下降，序列相似性在94％、89％和84％時(shí)，對(duì)2個(gè)dsRNA脫靶效應(yīng)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率分別為14.3％和33.3％、2.6％和8.3％，以及1.0％和1.7％。在果蠅活體和S2細(xì)胞中

10、利用dsWg進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，dsCheck預(yù)測(cè)都有23個(gè)基因脫靶，但實(shí)際檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分別僅有12個(gè)和3個(gè)基因表達(dá)受到抑制，表明昆蟲(chóng)活體內(nèi)的脫靶效應(yīng)和組培細(xì)胞中的有所不同。這些研究結(jié)果均表明dsCheck軟件預(yù)測(cè)dsRNA的脫靶基因準(zhǔn)確率極低，主要是由于目前預(yù)測(cè)軟件僅依據(jù)理論生成siRNA與基因組內(nèi)不同基因的相似性，沒(méi)有掌握dsRNA脫靶的發(fā)生規(guī)律，故還需深入開(kāi)展研究。
　　4.影響dsRNA脫靶效應(yīng)的分子特征
　　RNAi的

11、效應(yīng)分子與非靶標(biāo)基因的互作，造成非靶標(biāo)基因的沉默稱(chēng)為RNAi的脫靶效應(yīng)。本文基于目標(biāo)基因沉默水平，利用定量PCR方法評(píng)估了dsRNA分子的兩個(gè)重要特征對(duì)脫靶效應(yīng)的影響。結(jié)果首先發(fā)現(xiàn)，在赤擬谷盜中，當(dāng)dsRNA序列與mRNA序列相似度超過(guò)50％時(shí)，脫靶效應(yīng)發(fā)生的概率逐漸增加，當(dāng)相似度達(dá)到80％時(shí)，這些非靶標(biāo)的mRNA將與靶標(biāo)基因一樣被沉默。然后使用嵌合dsRNA序列檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)dsRNA序列與mRNA序列有一段40bp或者兩段30bp的連

12、續(xù)匹配時(shí)，就能夠引發(fā)RNAi效應(yīng)，而較短的匹配片段則無(wú)法觸發(fā)RNAi反應(yīng)。這些結(jié)果提供了昆蟲(chóng)體內(nèi)評(píng)估dsRNA脫靶效應(yīng)的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，這不僅會(huì)改善dsRNA的設(shè)計(jì)，同時(shí)會(huì)為未來(lái)RNAi的使用提供更好的理論依據(jù)。
　　5.赤擬谷盜RNAi過(guò)程中非序列特異性脫靶效應(yīng)的探索
　　昆蟲(chóng)體內(nèi)的免疫反應(yīng)是昆蟲(chóng)機(jī)體抵抗外界物質(zhì)侵染的能力，RNAi作為昆蟲(chóng)消除外界病毒RNA的重要途徑在進(jìn)化上相對(duì)保守，而對(duì)外源雙鏈RNA是否能夠引發(fā)昆蟲(chóng)的免疫應(yīng)答