微管解聚對(duì)心肌細(xì)胞電生理特性的影響及微管定量分析方法研究.pdf

1、微管是心肌細(xì)胞的主要骨架成分，參與維持細(xì)胞形態(tài)等一系列重要生理活動(dòng)?！靶菘诵摹崩碚撜J(rèn)為，在嚴(yán)重?zé)齻l(fā)的心功能損害中，缺氧導(dǎo)致的微管解聚至關(guān)重要。然而，微管解聚對(duì)作為心肌細(xì)胞活性與功能基礎(chǔ)的電生理方面的作用一直缺乏系統(tǒng)的研究和觀察。另外，高度動(dòng)態(tài)平衡的微管系統(tǒng)的研究一直依賴于顯微成像技術(shù)，這種傳統(tǒng)的方法存在觀察者主觀偏差等致命缺陷。因此，探討可客觀量化微管形態(tài)變化的新方法將為缺氧引起的微管解聚帶來(lái)新的認(rèn)識(shí)。
　　本研究以大鼠乳鼠心

2、肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用固定濃度、固定時(shí)間的秋水仙堿處理模擬特定缺氧環(huán)境下微管解聚的效應(yīng)。將上述微管解聚效應(yīng)作為單一實(shí)驗(yàn)因素來(lái)觀察大鼠乳鼠心肌細(xì)胞各項(xiàng)電生理指標(biāo)變化，以分析單純微管解聚所引起的電生理特性改變及機(jī)制。同時(shí)，基于標(biāo)記微管形態(tài)的H9C2心肌細(xì)胞熒光圖像，用灰度直方圖(GLH)特征參數(shù)比較量化了秋水仙堿和缺氧引起微管解聚后微管形態(tài)變化，以進(jìn)一步明確兩者的對(duì)照關(guān)系。
　　一、材料與方法
　　1.體外SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞

3、分離培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組和微管解聚組。觀察秋水仙堿處理后微管變化:免疫熒光染色標(biāo)記α微管蛋白，激光共聚焦顯微鏡下觀察微管形態(tài)變化;蛋白免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)游離/聚合態(tài)α微管蛋白的含量變化。
　　2.體外SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組和微管解聚組。觀察秋水仙堿處理后電生理特性及耗氧量變化:倒置顯微鏡下實(shí)時(shí)錄制自主搏動(dòng)以計(jì)算其搏動(dòng)頻率;全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄心肌細(xì)胞動(dòng)作電位(AP)、延遲整流型鉀離子通道電流(IK)和L

4、型鈣離子通道電流(ICa-L);氧微電極系統(tǒng)測(cè)定培養(yǎng)液中溶解氧濃度，間接反應(yīng)心肌細(xì)胞耗氧量。
　　3.H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)，分為正常對(duì)照組、缺氧組和秋水仙堿組。基于熒光標(biāo)記微管的數(shù)字圖像進(jìn)行定量分析:α微管蛋白免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡獲取微管數(shù)字圖像，Matlab7.0等軟件進(jìn)行單細(xì)胞分割、去噪、等比例分區(qū)等處理并提取GLH特征參數(shù)。
　　二、主要結(jié)果
　　1.正常對(duì)照組乳鼠心肌細(xì)胞微管呈現(xiàn)線性管狀形態(tài)，結(jié)構(gòu)清晰

5、完整，以核周為中心放射狀分布。微管解聚組細(xì)胞微管卷曲，念珠樣改變，結(jié)構(gòu)遭破壞而斷裂，呈彌漫性分布，熒光強(qiáng)度也降低。微管解聚組聚合態(tài)微管蛋白含量降低，游離態(tài)微管蛋白含量增高。
　　2.微管解聚后乳鼠心肌細(xì)胞較正常對(duì)照組自主搏動(dòng)頻率明顯升高，耗氧量也相應(yīng)增加。
　　3.微管解聚組乳鼠心肌細(xì)胞AP形態(tài)發(fā)生明顯變化，復(fù)極化平臺(tái)期不明顯，動(dòng)作電位時(shí)程(APD)明顯縮短，靜息電位（RP）和動(dòng)作電位振幅(AMP)未見(jiàn)明顯變化。
　　

6、4.微管解聚組乳鼠心肌細(xì)胞IK電流增強(qiáng)，其Ⅰ-Ⅴ曲線較正常對(duì)照組上移，激活后各測(cè)試電壓下(0-40mV) IK電流密度峰值均增加;然而，ICa-L電流未見(jiàn)變化，其Ⅰ-Ⅴ曲線與正常對(duì)照組基本重疊，激活后各測(cè)試電壓下(-30-50mV) ICa-L電流密度峰值無(wú)明顯改變。
　　5.與正常對(duì)照組相比，缺氧組和秋水仙堿組H9C2心肌細(xì)胞微管形態(tài)量化參數(shù)呈類似的變化趨勢(shì);且兩組均是在與細(xì)胞膜連接的正端更明顯。
　　三、結(jié)論
　　

7、1.微管解聚后IK增強(qiáng)，ICa-L電流不變，使得AP復(fù)極化增快，進(jìn)而縮短APD，增快心肌細(xì)胞自主搏動(dòng)頻率，增加其耗氧量，這可能是造成或加重心肌缺氧損害的重要因素。
　　2.基于熒光圖像，以GLH特征參數(shù)（均值，方差，偏度，峰度，能量，熵）量化微管形態(tài)是切實(shí)可行的。該方法證實(shí):缺氧及秋水仙堿處理后心肌細(xì)胞整體及區(qū)域內(nèi)微管形態(tài)量化特征相類似，存在對(duì)照關(guān)系。微管熒光圖像形態(tài)學(xué)灰度分析法能更加準(zhǔn)確地分析判斷缺氧心肌細(xì)胞微管的變化及其程度，