荔枝核乙酸乙酯相抑制HepG2細(xì)胞增殖及其抗肝癌免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、1.研究目的與意義
　　本研究的目的是對(duì)荔枝核乙酸乙酯相(Litch seeds ethyl aetate,LEA)進(jìn)行成分提取與分離，在前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)比HepG2和MCF-7的抑瘤作用，篩選出對(duì)LEA敏感的細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，并進(jìn)一步探討LEA對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖影響及其誘導(dǎo)凋亡機(jī)制；其次是闡明LEA在體內(nèi)抑制H22實(shí)體瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，該成果將為荔枝核有效成分的藥理藥效深入研究提供基礎(chǔ)。
　　本研究

2、的意義在于初步篩選出的LEA具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，在確定可抑制腫瘤細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)上，分析其可能的藥效成分為總黃酮類化合物，這將為荔枝核抗腫瘤藥理作用的深入研究及新藥研發(fā)提供有應(yīng)用價(jià)值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　2.研究方法
　　2.1.LEA的提取、分離及有效成分鑒別
　　本實(shí)驗(yàn)采用70％乙醇浸提，并結(jié)合超聲助提的方法獲取荔枝核總化合物成分，再通過(guò)萃取分離、干燥獲得 LEA，作為抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的藥物成分；再采用鹽酸-鎂粉反應(yīng)方

3、法鑒別LEA中的總黃酮成分，同時(shí)采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮的含量。
　　2.2.LEA對(duì)HepG2、MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用
　　本研究通過(guò)對(duì)比肝癌HepG2細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑瘤效果，利用不同濃度的LEA分別作用于腫瘤細(xì)胞24h和48h后，采用MTT法檢測(cè)LEA對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率并繪制抑制曲線；結(jié)晶紫染色法對(duì) LEA作用腫瘤細(xì)胞之后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察，從中選取 LEA作用效果最佳的腫瘤細(xì)胞系，然后進(jìn)行體內(nèi)

4、的抗腫瘤相關(guān)機(jī)制研究。
　　2.3.LEA對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖影響
　　為了探討 LEA對(duì)正常淋巴細(xì)胞的影響，采用小鼠原代脾臟淋巴細(xì)胞、胸腺淋巴細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用不同濃度的LEA分別作用于淋巴細(xì)胞24h和48h后，采用MTT法檢測(cè)LEA對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖的影響并繪制曲線圖；分析確定LEA對(duì)正常淋巴細(xì)胞無(wú)毒性作用的藥效濃度以及可以增強(qiáng)淋巴細(xì)胞活性的淋巴細(xì)胞。
　　2.4.LEA對(duì)共培養(yǎng)體系的影響研究

5、>　　通過(guò)LEA對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的增殖篩選，選擇脾臟淋巴細(xì)胞與HepG2細(xì)胞（3:1）的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，LEA作用24h后，吸出懸浮的淋巴細(xì)胞和含藥物的培養(yǎng)液，MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率并繪制抑制曲線。研究 LEA對(duì)共培養(yǎng)體系的影響，是為探討藥物對(duì)瘤細(xì)胞及淋巴細(xì)胞共存時(shí)的藥效變化，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　2.5.LEA誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
　　采用流式細(xì)胞術(shù)、DNA Ladder研究LEA對(duì)HepG2細(xì)

6、胞的凋亡機(jī)制，在不同濃度LEA作用24h后，采用Annexin-V/PI雙染凋亡檢測(cè)HepG2細(xì)胞的總凋亡率，再通過(guò)DNA Ladder實(shí)驗(yàn)是否形成明顯的梯狀條帶，以此判斷LEA是否誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，以及采用羅丹明123檢測(cè)LEA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體?Ψm的前后變化。
　　2.6 LEA對(duì)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響
　　使用BALB/c小鼠腋下接種H22細(xì)胞以構(gòu)建肝癌實(shí)體瘤造模。分別采用不同濃度LEA和5

7、-Fu對(duì)肝癌小鼠進(jìn)行治療，分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物（高、中、低）劑量組，灌胃給藥1次/d,連續(xù)10天。每天觀察小鼠生活狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各組小鼠眼球取血備用，完整剝離瘤塊、胸腺和脾臟并稱重,計(jì)算抑瘤率和器官指數(shù)，同時(shí)使用MTT法測(cè)定腫瘤小鼠脾臟淋巴、胸腺淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的增殖指數(shù)；ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β、TNF-α、INF-γ的分泌情況。
　　3.研究結(jié)果
　　3.1.LEA提取與鑒定
　　經(jīng)過(guò)荔枝

8、核干燥醇提萃取獲得 LEA，經(jīng)紫外分光光度法鑒定，LEA總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）為0.91mg/ml，荔枝核粗提取物總黃酮含量（以蘆丁計(jì)）為0.21mg/ml。由此可見(jiàn)LEA的總黃酮含量明顯高于荔枝核粗提取含量。
　　3.2.LEA對(duì)HepG2、MCF-7細(xì)胞的作用
　　LEA作用HepG2、MCF-7細(xì)胞，24h較48h明顯，IC50分別為為59.52μg/ml、301.7μg/ml；在經(jīng)過(guò)結(jié)晶紫染色法鑒定，藥物濃度在30μ

9、g/ml-240μg/ml范圍內(nèi)，藥物濃度越高，貼壁細(xì)胞越少，結(jié)晶紫染色就越淺。通過(guò)以上結(jié)果比較，LEA對(duì) HepG2細(xì)胞的抑制效果比MCF-7明顯，下一步的實(shí)驗(yàn)將確定HepG2細(xì)胞為藥物作用細(xì)胞系。
　　3.3.LEA對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的影響
　　LEA在60μg/ml時(shí)對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖率達(dá)到了321.33%，與對(duì)照組相比有顯著性(P<0.01)，說(shuō)明LEA在30μg/ml-240μg/ml濃度區(qū)間，對(duì)正常淋巴細(xì)胞

10、無(wú)毒性，超過(guò)240μg/ml，細(xì)胞狀態(tài)改變，異常堆積，無(wú)法清晰看出細(xì)胞橢圓形態(tài)，說(shuō)明高濃度可能有毒性，因此，LEA的濃度選擇在30μg/ml-240μg/ml范圍內(nèi)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　3.4.LEA作用共培養(yǎng)體系的影響研究
　　在共培養(yǎng)體系中，選擇小鼠脾淋巴細(xì)胞與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)，單獨(dú)選用LEA為60μg/ml時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率為35.28%，當(dāng)LEA加入共培養(yǎng)系時(shí)抑制率達(dá)可到72.34%，抑制效果明顯增強(qiáng)。說(shuō)

11、明 LEA可能通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化而更好的抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　3.5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LEA誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡
　　Annexin-V/PI雙染凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)LEA為60μg/ml時(shí)作用脾細(xì)胞與肝癌HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)體系24h，總凋亡率達(dá)可達(dá)到57.78%。
　　3.6.LEA對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響
　　采用Mouse IL-1β ELISA試劑盒測(cè)定，得荷瘤小鼠中劑量組(30g/kg)的血清IL

12、-1β的含量為49.79 pg/ml；中劑量組的荷瘤小鼠脾臟上清液IL-1β的分泌含量為46.32 pg/ml，表明LEA在抑制腫瘤增長(zhǎng)的同時(shí)并對(duì)IL-1β具有促進(jìn)分泌作用，提示LEA可能通過(guò)上調(diào)IL-1β分泌水平防止淋巴細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)被抑制，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　4.結(jié)論
　　4.1.本課題通過(guò)醇提萃取方法對(duì)LEA進(jìn)行提取、分離，經(jīng)紫外分光光度法鑒定總黃酮含量為0.91mg/ml。
　　4.2.確

13、定LEA作用瘤細(xì)胞HepG2的IC50為59.52μg/ml，抑制HepG2細(xì)胞的有效濃度在30-120μg/ml之間，最大抑制率可達(dá)57.26%，并對(duì)正常淋巴細(xì)胞無(wú)毒性作用，可一定程度上起到活化免疫細(xì)胞的效應(yīng)。
　　4.3.LEA作用小鼠脾淋巴細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)體系，LEA為60μg/ml的抑制率達(dá)到72.34%，說(shuō)明了共培養(yǎng)體系聯(lián)合LEA能更好的發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞作用。
　　4.4.通過(guò)Annexin-V

14、/PI雙染對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示LEA為60μg/ml時(shí)作用脾細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)體系24h時(shí)，總凋亡率可達(dá)到57.78%。進(jìn)一步說(shuō)明LEA不但可以單獨(dú)抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)還可以通過(guò)活化脾淋巴細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。
　　4.5.進(jìn)一步體內(nèi)LEA抑制H22實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量組的抑瘤率可達(dá)到50.15%，測(cè)定免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況，IL-1β表達(dá)明顯增高，提示L