大鼠骨髓間質(zhì)干細胞神經(jīng)分化過程中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達的變化及意義.pdf

1、背景與目的:
　　 骨髓間質(zhì)干細胞（marrowmesenchymalstemcells，MSCs）是一類可以從成熟骨髓、臍帶血及脂肪組織等多種組織分離出來，具有多向分化潛能干細胞。MSCs具有很強的自我增殖、多向分化能力，在特定的條件下可以向不同的細胞進行分化，既可以向中胚層組織分化如骨細胞、心肌細胞等，又可以向外胚層組織分化如神經(jīng)細胞等。MSCs具有來源方便、增殖能力強大、多向分化潛能等優(yōu)點，因此在臨床主要應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病

2、，心血管疾病，以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷與治療。尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，MSCs的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)變性病、中樞神經(jīng)損傷等患者提供了新的治療方法，具有長遠的發(fā)展前景。誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細胞分化是一種橫向的分化方式，存在著分化效率低、分化調(diào)節(jié)機制不明確等缺點，因此需要進一步研究。
　　 TOR最初是在啤酒酵母的突變株TOR1和TOR2中發(fā)現(xiàn)的，TOR1和TOR2基因編碼兩個大的(280kDa)高度同源的(70％)TOR1和TOR2。19

3、96年，Abraham等在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)和功能保守的TOR，稱為mTOR。mTOR的C末端有一個激酶結(jié)構(gòu)域，約234個氨基酸，因此被認為是磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(PIKK)蛋白質(zhì)家族成員。在哺乳動物中只有一個mTOR基因，在人、小鼠和大鼠中都編碼2549個氨基酸，目前可以確定的是mTORC1至少包含mTOR、raptor和mLST8三種蛋白，而mTORC2至少包含mTOR、rictor和mLST8三種蛋白。mTOR的上下游信

4、號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較為復(fù)雜，胰島素、生長因子（胰島素樣生長因子，血小板源性生長因子和表皮生長因子等）合予跨膜胰島素受體或酪氨酸激酶受體(IR，RTK)后，激活Ⅰ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅠPDK)，使PIP被磷酸化為PIP3，PIP3結(jié)合于Akt/PKB和它的活化分子PDK1。mTOR效應(yīng)器4EBP1和S6Ks，mTOR活性抑制時，促進自噬體形成。PI3K/Akt/mTORC1信號通路是調(diào)控細胞生長與增殖的關(guān)鍵通路，該通路將營養(yǎng)分子、能

5、量狀態(tài)以及生長因子傳來的信號整合在一起，調(diào)控大量的生命過程，包括自噬、核糖體的生物合成和代謝等。
　　 因此本實驗以骨髓間質(zhì)干細胞為研究對象，通過不同濃度mTOR特異性抑制劑雷帕霉素的處理，觀察骨髓間質(zhì)干細胞神經(jīng)分化前后mTOR表達的變化。并初步探討大鼠骨髓間質(zhì)干細胞神經(jīng)分化過程中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達的變化及意義。
　　 材料和方法:
　　 實驗分五組骨髓間質(zhì)干細胞空白對照組、骨髓間質(zhì)干細胞β-

6、巰基乙醇誘導(dǎo)組、不同濃度雷帕霉素干預(yù)骨髓間質(zhì)干細胞組、不同濃度雷帕霉素干預(yù)骨髓間質(zhì)干細胞+骨髓間質(zhì)干細胞β-巰基乙醇誘導(dǎo)組、二甲基亞砜(DMSO)陰性對照組，雷帕霉素分3個濃度梯度:10μmol/L20μmol/L30μmol/L。常規(guī)體外培養(yǎng)大鼠MSCs，按照5×104cells/well比例接種于24孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞密度達70％～80％左右加入不同濃度的雷帊霉素處理液(10～30μmol/L)

7、，且每組處理液DMSO濃度均低于0.1％，作用24小時。采用免疫熒光法檢測誘導(dǎo)前后mTOR在細胞內(nèi)的分布，激光共聚焦顯微鏡觀察照相;WesternBlot法檢測誘導(dǎo)前后神經(jīng)細胞相關(guān)蛋白和mTOR通路蛋白的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、誘導(dǎo)前mTOR主要在骨髓間質(zhì)干細胞細胞核內(nèi)點狀分布，細胞質(zhì)也有少量的分布;誘導(dǎo)后核內(nèi)熒光信號減弱，mTOR向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。雷帕霉素處理后，隨著雷帕霉素濃度的提高(10～30μmol/L)，核

8、內(nèi)熒光信號減弱越明顯，mTOR向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移越明顯。雷帕霉素濃度超過50μmol/L后，細胞形態(tài)變圓，部分細胞脫壁，死亡率顯著增加(P＜0.05)。
　　 2、β-巰基乙醇可誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞，誘導(dǎo)后神經(jīng)細胞Tau蛋白、MAP-2蛋白表達顯著增加。雷帕霉素(10～30μmol/L)干預(yù)后，隨著雷帕霉素濃度(10～20μmol/L)的提高，Tau蛋白、MAP-2蛋白表達逐漸增加，30μmol/L時Tau蛋白、MAP-2