上皮鈉通道在糖皮質(zhì)激素致骨骼肌萎縮中的作用研究.pdf

1、目的：建立近交系和封閉群Wistar大鼠糖皮質(zhì)激素性骨骼肌萎縮（Glucocorticoid induced skeletal muscle atrophy,GIMA）模型并比較兩種品系大鼠GIMA模型的差異。觀察GIMA模型大鼠腓腸肌組織糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid receptor,GR）、α-上皮鈉離子通道(α- Epithelial sodium channel,α-ENaC)和肌萎縮盒 F基因(muscle a

2、trophy F-box,MAFbx) mRNA含量的變化，從整體動(dòng)物水平探究ENaC在GIMA發(fā)病中的作用。觀察體外培養(yǎng)成肌細(xì)胞C2C12在地塞米松（dexamethasone,Dex）和ENaC特異性阻斷劑——阿米洛利（Amilorid,Ami）干預(yù)下增殖和分化變化，從細(xì)胞水平探究ENaC功能變化對(duì)GC影響骨骼肌細(xì)胞再生的可能作用。
　　方法：近交系和封閉群Wistar大鼠各32只分別隨機(jī)分為4組給藥：對(duì)照組（C組）肌注生理鹽

3、水1.0mg/kg，每周3次；低頻組（L組）、中頻組（M組）和高頻組（H組）分別每周1、3、5次肌注 Dex1.0mg/kg，給藥90天。取大鼠右側(cè)腓腸肌進(jìn)行石蠟切片和HE染色，檢視肌纖維的形態(tài)及橫截面積變化；取左側(cè)腓腸肌進(jìn)行冰凍切片和肌纖維分型染色，觀察Ⅰ、Ⅱ兩型纖維變化，并提取總RNA進(jìn)行RT-PCR及q-PCR檢測(cè)GR、α-ENaC和MAFbx基因mRNA含量變化。用CCK-8法及肌管直徑測(cè)量法分別檢測(cè)不同濃度Dex（5×10-7

4、M~1.5×10-4M）和Ami（10-5M）單獨(dú)及聯(lián)合用藥對(duì)體外培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞C2C12增殖和分化的影響。
　　結(jié)果：①兩種品系大鼠M和H組體重較C組、L組顯著減少（P＜0.01）。②兩種品系大鼠H組腓腸肌系數(shù)較C組（P＜0.01）、L組均顯著降低（P＜0.05）。③近交系大鼠M組和H組肌纖維橫截面積均較C組、L組顯著減少（P＜0.01）。封閉群大鼠各用藥組隨用藥頻率增加肌纖維橫截面積顯著減少（P＜0.01）。④隨用藥頻率增加

5、，兩種品系大鼠各用藥組Ⅱ型纖維橫截面積均較C組顯著減少（P＜0.01），其中，近交系的變化呈頻率依賴性。⑤近交系大鼠各用藥組GR、α-ENaC和MAFbx基因mRNA含量均較C組有同步增加趨勢(shì)，其中，H組α-ENaC基因mRNA含量比C組、L組顯著增加（P＜0.01）；封閉群大鼠各用藥組MAFbx基因mRNA含量均比C組顯著增加（P＜0.05）；M組和H組α-ENaC mRNA含量較C組（P＜0.05）、L組（P＜0.01）顯著增加，但

6、M組和H組GR mRNA含量較C組（P＜0.05）、L組（P＜0.01）顯著減少。⑥D(zhuǎn)ex作用于C2C12細(xì)胞，24h時(shí)，在5×10-4M以下能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.05），而提升至1.5×10-4M則有抑制細(xì)胞增殖趨勢(shì)，但48h時(shí)，各濃度下均顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）。10-5M Ami作用C2C12細(xì)胞，24h時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖有顯著促進(jìn)（P＜0.05），當(dāng)延至48h則增殖未見顯著變化。10-5M Ami與Dex聯(lián)合作用C2C

7、12細(xì)胞，24h時(shí)，在Dex5×10-4M以下有促進(jìn)細(xì)胞增殖的趨勢(shì)，但增至1.5×10-4M則抑制細(xì)胞增殖；48h時(shí)，Dex各濃度下都有抑制細(xì)胞增殖的趨勢(shì)，且較單用Ami時(shí)更顯著抑制（P＜0.05）。⑦10-5M Ami及各濃度Dex單用或聯(lián)合作用于分化期C2C12細(xì)胞72h，細(xì)胞肌管直徑均顯著減少（P＜0.05），但未見濃度依賴性。
　　結(jié)論：以Dex1.0mg/kg每周3、5次肌注均可成功誘導(dǎo)兩種品系大鼠建立GIMA模型，近交

8、系模型較封閉群模型更具骨骼肌萎縮典型病變及GC的量-效效應(yīng)。GC用藥可使兩種品系GIMA大鼠骨骼肌組織α-ENaC和MAFbx基因mRNA含量增加，同時(shí)，近交系模型的GR基因表達(dá)增加呈濃度依賴性趨勢(shì)，且與α-ENaC和MAFbx基因表達(dá)同步增加，顯示了近交系模型骨骼肌肌纖維對(duì)GC作為信號(hào)分子所誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有較為一致的群體響應(yīng)，體現(xiàn)出近交系動(dòng)物在基因背景研究中的優(yōu)勢(shì)，也提示了骨骼肌肌纖維GR介導(dǎo)外源性GC誘導(dǎo)骨骼肌ENaC基因和萎縮基

9、因高表達(dá)可能與GIMA的發(fā)生相關(guān)。此外，以不同用藥頻率和時(shí)長的Dex及Ami干預(yù)體外培養(yǎng)成肌細(xì)胞C2C12的增殖和肌管直徑變化結(jié)果顯示，GC對(duì)成肌細(xì)胞增殖可能有雙向調(diào)節(jié)作用，即低濃度、短期用藥促進(jìn)細(xì)胞增殖而高濃度、長期用藥抑制細(xì)胞增殖，并抑制成肌細(xì)胞分化。當(dāng)ENaC功能受短期抑制后可促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，但對(duì)成肌細(xì)胞分化均表現(xiàn)抑制，且在GC作用下，Ami對(duì)細(xì)胞增殖和分化的抑制更顯著，提示骨骼肌肌纖維ENaC可能參與了成肌細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控