NO合酶抑制蛋白參與商陸皂苷甲抗炎調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、【研究目的】
　　 中藥商陸系商陸屬植物商陸和垂序商陸的干燥根，為歷版中國(guó)藥典收載品種。商陸的水溶性成分中主要是多種具生理活性的商陸皂苷（Esculentoside，Es），從中的分離的單體稱為商陸皂苷甲（Esculentoside A，EsA）。以往的研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對(duì)體液免疫和非特異性細(xì)胞免疫有顯著的抑制活性。近年來(lái)有研究者采用基因芯片技術(shù)比對(duì)正常胸腺細(xì)胞和經(jīng)過(guò)EsA處理的胸腺細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)若干表達(dá)差異基因，其中包括同

2、炎性介質(zhì)一氧化氮相關(guān)的NO合酶抑制蛋白(protein inhibitor of nitric oxide synthase，PIN) mRNA的表達(dá)上調(diào)，推測(cè)該蛋白的表達(dá)上調(diào)與EsA抗炎作用機(jī)理有關(guān)。
　　 PIN是含89個(gè)氨基酸的多肽，生物進(jìn)化過(guò)程序列高度保守，并且在多種組織中表達(dá)。PIN能結(jié)合超過(guò)15種的蛋白分子和mRNA，這些蛋白功能涉及細(xì)胞凋亡、酶活性調(diào)控、腫瘤形成、器官發(fā)育、胰島素釋放等。據(jù)此有人將PIN 歸類為多功

3、能的樞紐蛋白（hub protein）。
　　 近來(lái)有關(guān)PIN同炎癥免疫調(diào)控方面的報(bào)道引起我們的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)PGE2、TNF-a可誘導(dǎo)神經(jīng)元和Rat-1細(xì)胞系PIN表達(dá)。在纖維母細(xì)胞中，cAMP水平提高能促使PIN蛋白表達(dá)上調(diào)從而調(diào)控與炎癥、凋亡密切相關(guān)的蛋白激酶p38信號(hào)途徑。而在人肥大細(xì)胞中，PIN能與nNOS 結(jié)合調(diào)控白三烯的產(chǎn)生。這些結(jié)果提示PIN可能作為細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白，參與細(xì)胞外信號(hào)對(duì)炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)控

4、。
　　 另外，PIN獨(dú)特的分子結(jié)合特性也引起我們的注意。一系列研究發(fā)現(xiàn)，PIN分子是一個(gè)緊密結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)（dimer），在二聚體表面的對(duì)稱位置上存在兩個(gè)序列完全相同的多肽結(jié)合凹槽(groove)，凹槽能識(shí)別和結(jié)合具有（K/R）XTQT或G（I/V）QVD 指紋區(qū)結(jié)構(gòu)的的靶蛋白。如果結(jié)合指紋區(qū)（K/R）XTQT 或G（I/V）QVD 部分氨基酸替換，靶蛋白則不能與PIN 結(jié)合，這表明（K/R）XTQT 或G（I/V）QVD

5、結(jié)構(gòu)具有序列特異性。
　　 研究還發(fā)現(xiàn)，PIN與靶蛋白結(jié)合后可促進(jìn)這些局部構(gòu)象異?；謴?fù)正?；蛐纬煞€(wěn)定結(jié)構(gòu)。因此PIN蛋白具有結(jié)合并調(diào)節(jié)靶蛋白功能的活性。PIN能與核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白IkB結(jié)合，阻止其被IKK磷酸化、負(fù)調(diào)控NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性；某些氧化因子使PIN第二位上的半胱氨酸殘基脫氫后，通過(guò)二硫鍵形成穩(wěn)定的PIN二聚體，可以解除PIN對(duì)IkB的結(jié)合，促進(jìn)NF-kB轉(zhuǎn)錄活性。
　　 據(jù)此我們?cè)O(shè)想：是否可能設(shè)計(jì)具有（K/

6、R）XTQT 或G（I/V）QVD 結(jié)構(gòu)的短肽
　　 【研究目的】
　　 中藥商陸系商陸屬植物商陸和垂序商陸的干燥根，為歷版中國(guó)藥典收載品種。商陸的水溶性成分中主要是多種具生理活性的商陸皂苷（Esculentoside，簡(jiǎn)稱Es），從中的分離的單體稱為商陸皂苷甲（Esculentoside A，簡(jiǎn)稱EsA）。以往的研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對(duì)體液免疫和非特異性細(xì)胞免疫有顯著的抑制活性。近年來(lái)有研究者采用基因芯片技術(shù)比對(duì)正常胸腺細(xì)胞和

7、經(jīng)過(guò)EsA處理的胸腺細(xì)胞的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)若干表達(dá)差異基因，其中包括同炎性介質(zhì)一氧化氮相關(guān)的NO合酶抑制蛋白(protein inhibitor of nitric oxide synthase，PIN) mRNA的表達(dá)上調(diào)，推測(cè)該蛋白的表達(dá)上調(diào)與EsA抗炎作用機(jī)理有關(guān)。
　　 PIN是含89個(gè)氨基酸的多肽，生物進(jìn)化過(guò)程序列高度保守，并且在多種組織中表達(dá)。PIN能結(jié)合超過(guò)15種的蛋白分子和mRNA，這些蛋白功能涉及細(xì)胞凋亡、酶活

8、性調(diào)控、腫瘤形成、器官發(fā)育、胰島素釋放等。據(jù)此有人將PIN 歸類為多功能的樞紐蛋白（hub protein）。
　　 近來(lái)有關(guān)PIN同炎癥免疫調(diào)控方面的報(bào)道引起我們的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)PGE2、TNF-a可誘導(dǎo)神經(jīng)元和Rat-1細(xì)胞系PIN表達(dá)。在纖維母細(xì)胞中，cAMP水平提高能促使PIN蛋白表達(dá)上調(diào)從而調(diào)控與炎癥、凋亡密切相關(guān)的蛋白激酶p38信號(hào)途徑。而在人肥大細(xì)胞中，PIN能與nNOS 結(jié)合調(diào)控白三烯的產(chǎn)生。這些結(jié)果

9、提示PIN可能作為細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)蛋白，參與細(xì)胞外信號(hào)對(duì)炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)控。
　　 另外，PIN獨(dú)特的分子結(jié)合特性也引起我們的注意。一系列研究發(fā)現(xiàn)，PIN分子是一個(gè)緊密結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)（dimer），在二聚體表面的對(duì)稱位置上存在兩個(gè)序列完全相同的多肽結(jié)合凹槽(groove)，凹槽能識(shí)別和結(jié)合具有（K/R）XTQT或G（I/V）QVD 指紋區(qū)結(jié)構(gòu)的的靶蛋白。如果結(jié)合指紋區(qū)（K/R）XTQT 或G（I/V）QVD 部分氨基酸替換，靶蛋白

10、則不能與PIN 結(jié)合，這表明（K/R）XTQT 或G（I/V）QVD 結(jié)構(gòu)具有序列特異性。
　　 研究還發(fā)現(xiàn)，PIN與靶蛋白結(jié)合后可促進(jìn)這些局部構(gòu)象異常恢復(fù)正?；蛐纬煞€(wěn)定結(jié)構(gòu)。因此PIN蛋白具有結(jié)合并調(diào)節(jié)靶蛋白功能的活性。PIN能與核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白IkB結(jié)合，阻止其被IKK磷酸化、負(fù)調(diào)控NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性；某些氧化因子使PIN第二位上的半胱氨酸殘基脫氫后，通過(guò)二硫鍵形成穩(wěn)定的PIN二聚體，可以解除PIN對(duì)IkB的結(jié)合，促進(jìn)N

11、F-kB轉(zhuǎn)錄活性。
　　 據(jù)此我們?cè)O(shè)想：是否可能設(shè)計(jì)具有（K/R）XTQT 或G（I/V）QVD 結(jié)構(gòu)的短肽分子，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)與PIN 結(jié)合，阻斷PIN同靶蛋白（比如IkB）的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能的某種調(diào)節(jié)。
　　 商陸在中國(guó)用于某些急性炎癥疾病的治療由來(lái)已久，我們希望通過(guò)該課題的研究對(duì)這一傳統(tǒng)中藥有效成分——商陸皂苷甲（EsA）的作用機(jī)理進(jìn)行闡述，對(duì)EsA抗炎活性同PIN蛋白的關(guān)系進(jìn)行分析，對(duì)EsA提高PIN蛋白的作用機(jī)

12、理進(jìn)行研究。
　　 另外，我們?cè)O(shè)計(jì)具有PIN結(jié)合基序的短肽，在細(xì)胞水平研究短肽分子對(duì)PIN抗炎免疫調(diào)節(jié)作用，在蛋白功能調(diào)節(jié)水平上進(jìn)一步闡明PIN的作用，同時(shí)希望發(fā)現(xiàn)一種全新的炎癥免疫調(diào)控方式和新型的抗炎免疫藥物的先導(dǎo)分子。
　　 【研究方法】
　　 （一）PIN參與EsA抗炎免疫效應(yīng)活性作用機(jī)理的研究
　　 1、EsA對(duì)TNF-a的調(diào)控作用：不同濃度EsA預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞后，加入LPS刺激12小

13、時(shí)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a的水平變化。EsA作用不同時(shí)間后收集細(xì)胞，real-time定量PCR檢測(cè)TNF-a的mRNA表達(dá)水平。
　　 2、EsA作用RAW264.7細(xì)胞，ELISA檢測(cè)cAMP水平變化，Western blot檢測(cè)PIN蛋白表達(dá)；以cAMP依賴性PKA抑制劑H-89處理細(xì)胞，Western blot檢測(cè)PIN蛋白表達(dá)的變化。
　　 3、RNA靶向干擾方法建立PIN低表達(dá)的RAW264.7細(xì)胞

14、；瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體方法建立PIN高表達(dá)RAW264.7細(xì)胞。
　　 4、LPS刺激PIN低表達(dá)細(xì)胞和PIN高表達(dá)細(xì)胞，ELISA檢測(cè)TNF-a、NO等炎性介質(zhì)的水平。
　　 5、在PIN低表達(dá)的RAW264.7細(xì)胞中，EsA預(yù)處理細(xì)胞，加入LPS，real-time定量PCR檢測(cè)對(duì)TNF-a mRNA表達(dá)水平。
　　 （二） 研究PIN結(jié)合短肽對(duì)IL-8產(chǎn)生的影響，以及對(duì)IkB磷酸化的影響
　　 1、設(shè)計(jì)