花旗松素對毒死蜱誘導(dǎo)BV2細(xì)胞神經(jīng)毒性保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:探討花旗松素（Tax）對毒死蜱（CPF）誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞神經(jīng)毒性的保護(hù)機(jī)制，為小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　方法:①BV2細(xì)胞隨機(jī)分為4組，因CPF和Tax均為脂溶性，易溶于DMSO，故設(shè)置DMSO組為對照組：DMSO組：含0.1％DMSO的RPMI1640完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)；CPF組：含200μmol/L CPF的RPMI1640完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞，作用時(shí)間6 h；Tax組：含

2、Tax的RPMI1640完全培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)；Tax+CPF組：含100μmol/L Tax的RPMI1640完全培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞，作用時(shí)間6 h；再用含200μmol/L CPF的RPMI1640完全培養(yǎng)基處理細(xì)胞，作用時(shí)間6 h。②CCK-8法檢測Tax對BV2細(xì)胞活力的影響；光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；③熒光染色法檢測 BV2細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平；④酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測細(xì)胞上清

3、TNF-α和IFN-γ蛋白表達(dá)；⑤免疫熒光染色（IF）檢測自噬標(biāo)志性蛋白 LC3Ⅱ表達(dá)；⑥免疫印跡法（Western blot）檢測 p-AMPK, AMPK,Nrf2, HO-1,p62蛋白表達(dá)水平以及Conpound C阻斷AMPK通路后，再次檢測上述蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:①光鏡下可見CPF誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞胞體變圓，細(xì)胞突觸萎縮，且貼壁性變差，細(xì)胞聚集漂??；Tax、Tax+CPF兩組BV2細(xì)胞形態(tài)較為靠近DMSO組，貼壁性

4、較CPF組好，無明顯聚集現(xiàn)象。②熒光顯微鏡下觀察可見DMSO組綠色熒光很少且亮度較弱，CPF組綠色熒光較多且亮度增強(qiáng)，而Tax和Tax+CPF靈族細(xì)胞綠色熒光減少且熒光亮度減弱。與DMSO組比較，CPF組ROS增多，Tax、Tax+CPF組ROS無增多；與CPF組比較，Tax、Tax+CPF組ROS降低。③ELISA檢測各組細(xì)胞上清液中TNF-α和IFN-γ水平示：與DMSO組比較，CPF、Tax+CPF兩組細(xì)胞TNF-α和IFN-γ水

5、平升高，Tax組細(xì)胞TNF-α水平無升高，IFN-γ水平升高；與CPF組比較，Tax和Tax+CPF組細(xì)胞TNF-α和IFN-γ的水平均有下降。④免疫熒光染色.結(jié)果示：LC3 II主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，與DMSO組比較，CPF組細(xì)胞LC3 II在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)未見增多，Tax和Tax+CPF兩組細(xì)胞LC3 II在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)增多。同時(shí)，western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與DMSO組比較，CPF組細(xì)胞p62相對表達(dá)無顯著差異；Tax組細(xì)胞p

6、62相對表達(dá)量增多，Tax+CPF組細(xì)胞p62下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果示：與DMSO組比較，CPF組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無明顯改變，Tax組AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)無顯著改變， Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Tax+CPF組AMPK蛋白無顯著改變，p-AMPK蛋白表達(dá)減少，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著增加；與CPF組比較，Tax組AMPK、

7、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著改變，Tax+CPF組p-AMPK蛋白表達(dá)減少，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Conpound C干預(yù)各組BV2細(xì)胞1 h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見與DMSO組比較，CPF組AMPK蛋白表達(dá)顯著減少， Tax組AMPK、Nrf2蛋白表達(dá)明顯減少，p-AMPK、HO-1蛋白表達(dá)減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Tax+CPF組AMPK、p-AMPK顯著較少，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著

8、差異；與CPF組比較，Tax組AMPK顯著升高，p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著差異，Tax+CPF組AMPK、p-AMPK、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)無顯著差異。
　　結(jié)論:①CPF對BV2細(xì)胞具有毒性作用，表現(xiàn)為BV2細(xì)胞胞體變圓，細(xì)胞突觸萎縮，且貼壁性變差，細(xì)胞聚集漂浮，BV2細(xì)胞存活率降低。同時(shí)，CPF可以上調(diào)ROS、TNF-α、IFN-γ水平，誘導(dǎo)BV2細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)。②Tax可以改善BV2細(xì)胞