人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合辛伐他汀對高糖環(huán)境RF-6A細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察辛伐他汀對高糖培養(yǎng)的恒河猴視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（RF/6A）的生物學(xué)特性的影響，研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）聯(lián)合辛伐他汀對高糖培養(yǎng)的RF/6A細(xì)胞的保護(hù)作用及Toll樣受體4（toll-like receptor4，TLR4）炎癥信號通路的變化，探討hUCMSCs聯(lián)合辛伐他汀對RF/6A的炎癥調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
　　方法：(1

2、)取第3~5代處于對數(shù)生長期的RF/6A細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為6組，正常對照組（NG組）、高糖組（HG組）、辛伐他汀0.1μmol/L組（SIM0.1組）、辛伐他汀1μmol/L組（SIM1組）、辛伐他汀5μmol/L組（SIM5組）、辛伐他汀10μmol/L組（SIM10組）。RF/6A細(xì)胞長到60％~70%時(shí)，換用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時(shí)，加入不同濃度的辛伐他汀干預(yù)24小時(shí)后檢測。采用MTT法檢測各組RF/6A細(xì)胞的增殖能力；粘附能力測定實(shí)驗(yàn)

3、檢測各組 RF/6A細(xì)胞的粘附能力；Transwell小室檢測各組RF/6A細(xì)胞的遷移能力；成管實(shí)驗(yàn)檢測各組RF/6A細(xì)胞的管腔形成能力。（2）取第3~5代處于對數(shù)生長期的RF/6A細(xì)胞和hUCMSCs，實(shí)驗(yàn)分為5組，正常對照組（NG組）、高糖組（HG組）、辛伐他汀1μmol/L組（SIM組）、hUCMSCs1:1 RF/6A組（MSCs組）、辛伐他汀1μmol/L聯(lián)合hUCMSCs1:1 RF/6A組（SIM+MSCs組）。MSCs組

4、采用 Transwell小室共培養(yǎng)系統(tǒng)，上層小室放置hUCMSCs，下層小室放置RF/6A細(xì)胞。SIM+MSCs組在共培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)液中加入1μmol/L辛伐他汀。采用MTT法檢測各組RF/6A細(xì)胞的增殖能力；粘附能力測定實(shí)驗(yàn)檢測各組RF/6A細(xì)胞的粘附能力；Transwell小室檢測各組RF/6A細(xì)胞的遷移能力；成管實(shí)驗(yàn)檢測各組 RF/6A細(xì)胞的管腔形成能力；細(xì)胞免疫熒光檢測各組RF/6A細(xì)胞TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1

5、β的表達(dá)；RT-PCR檢測各組RF/6A細(xì)胞TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）RF/6A細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、黏附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)及成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， HG組 RF/6A細(xì)胞的增殖能力、粘附能力、遷移能力、管腔形成能力明顯低于NG組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SIM0.1組、SIM1組、SIM5組RF/6A細(xì)胞增殖能力(0.32±0.02、0.36±0.01、0.27±0.02)較HG

6、組(0.15±0.01)提高(P均<0.05)，但SIM10組RF/6A細(xì)胞增殖能力（0.14±0.03）較HG組下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.79，P>0.05）；SIM0.1組、SIM1組、SIM5組黏附細(xì)胞所占面積百分比[（34.08±1.89）%、（46.23±1.02）%、（26.05±2.12）%/200倍視野]較HG組[（16.17±2.84）%/200倍視野]提高(P均<0.05)，但SIM10組RF/6A細(xì)胞粘附能力

7、[（10.46±1.27）%/200倍視野]較HG組下降（P<0.05）；SIM0.1組、SIM1組、SIM5組、SIM10組遷移細(xì)胞所占面積百分比[(23.28±2.38)%、（33.15±2.91）%、（17.06±1.03）%、（13.49±0.57）%/40倍視野]較HG組[（10.26±2.05）%/40倍視野]提高(P均<0.05)； SIM0.1組、SIM1組、SIM5組、SIM10組RF/6A管腔形成能力[（15.40±

8、1.51）、（19.80±0.84）、（11.20±1.30）、（8.00±1.00）個(gè)細(xì)胞/40倍視野]較HG組[（5.40±1.14）個(gè)細(xì)胞/40倍視野]提高(P均<0.05)。（2）SIM組、MSCs組、SIM+MSCs組RF/6A細(xì)胞的增殖能力、粘附能力、遷移能力、管腔形成能力較HG組提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，HG組TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達(dá)較NG組增強(qiáng)，SIM+MS

9、Cs組TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α的表達(dá)較HG組減弱。RT-PCR結(jié)果顯示，與HG組比較，NG組RF/6A細(xì)胞TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)增加（P均<0.05），與HG組比較，SIM+MSCs組TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表達(dá)下降（P均<0.05），SIM組NF-κB、IL-1β、TNF-α、MSCs組TLR4 mRNA表達(dá)較HG組無明顯變化（P均>0.05）。
　　結(jié)論