BACE1蘇木化修飾增強其穩(wěn)定性并加劇Aβ的毒性和認知障礙.pdf

1、本文從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 BACE1蘇木化修飾增強其穩(wěn)定性并加劇Aβ的毒性和認知障礙
　　背景：AD(Alzheimer’s disease)是最常見的神經(jīng)退行病變，細胞外老年斑（senile plaque,SP）的沉積是AD重要的特征是最常見的神經(jīng)退行病變，細胞外老年斑（senile plaque,SP）的沉積是AD重要的特征性神經(jīng)病理學(xué)變化之一。SP由前體蛋白APP剪切而生成的β切淀粉樣蛋白（β粉樣蛋白

2、（β經(jīng)病，A粉）聚集而成。β分泌酶（亦稱BACE1）剪切APP生成C端片段（C99）和N端片段（sAPP1），C99再經(jīng)分泌酶剪切生成具有神經(jīng)毒性的A經(jīng)分泌酶剪切生成以及C端片段（C57，C59），因此BACE1剪切APP是AP生成的關(guān)鍵步驟，BACE1是AA生成的關(guān)鍵酶。AD病人腦內(nèi)BACE1表達量顯著增加，但目前相關(guān)機制不清。蘇木化修飾（SUMOylation）作為一種重要的翻譯后修飾，其過程是蘇木小體（SUMO1-4）在一系列酶的

3、作用下結(jié)合與于靶蛋白的特異序列:ψ-K-X-D/E（ψ代表疏水性氨基酸，X代表任意氨基酸）或NDSM（負電荷依賴的蘇木結(jié)合序列），其功能是通過對底物蛋白進行蘇木化修飾改變靶蛋白的構(gòu)象、功能、穩(wěn)定性以及亞細胞定位。現(xiàn)有研究表明蘇木化修飾在AD的病理過程中發(fā)揮重要作用，基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蘇木化相關(guān)的基因是AD重要的危險因素，在Tg2576轉(zhuǎn)基因模型鼠腦內(nèi)SUMO1水平升高并與磷酸化Tau蛋白共定位。課題組前期的研究也證實細胞中Tau蛋白SUM

4、O1修飾與磷酸化相互促進，與泛素化相競爭，從而減少Tau降解，促進Tau聚集。然而SUMO1是否參與Aβ的形成以及相關(guān)機制尚不清晰。我們通過蘇木化位點預(yù)測軟件SUMOsp2.0對BACE1進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)BACE1存在著蘇木小體結(jié)合的特異序列274LKMD277和495DDISLLK501，提示BACE1可能與蘇木小體結(jié)合。
　　目的：探討B(tài)ACE1蘇木化修飾對Aβ的產(chǎn)生和認知障礙的影響及潛在的機制，為AD藥物開發(fā)提供有效特異的分子

5、靶點。
　　方法：培養(yǎng)HEK293T或N2A-APP細胞，同時瞬時轉(zhuǎn)染BACE1、SUMO1和蘇木特異性連接酶UBC9，并在整體水平AAV-BACE1定位注射C57小鼠海馬，通過免疫共沉淀方法檢測BACE1與蘇木小體SUMO-1結(jié)合程度。通過SUMOsp2.0預(yù)測BACE1可能的蘇木修飾位點，對其定位點突變K275R和K501R，并將突變或野生型的BACE1與SUMO-1、UBC9共轉(zhuǎn)HEK293T或N2A-APP細胞，通過免疫共

6、沉淀方法檢測BACE1蘇木化修飾水平。蘇木化位點特異性突變的BACE1、野生型BACE1與UBC9共轉(zhuǎn)N2A-APP細胞，利用免疫印跡和ELISA方法檢測BACE1蘇木化修飾對APP的剪切以及Aβ生成的影響，通過激光共聚焦檢測蘇木化修飾對BACE1亞細胞分布的影響。100mg/ml放線菌酮(Cycloheximide,CHX)對轉(zhuǎn)染后的N2A-APP細胞給予不同時間段的處理，免疫印跡檢測蘇木化修飾對BACE1穩(wěn)定性的影響。通過逆轉(zhuǎn)錄和R

7、T-PCR確定蘇木化修飾是否影響B(tài)ACE1的mRNA表達水平。C57小鼠海馬定位注射AAV-Vector、AAV-BACE1WT、AAV-BACE1K501R，通過曠場、水迷宮實驗來檢測行為學(xué)的變化，激光共聚集熒光顯微鏡下觀察MAP2表達水平和BACE1蛋白的亞細胞定位，高爾基染色檢測樹突棘的變化，免疫印跡實驗檢測小鼠海馬Synaptotagmin，Synaptophysin，Synapsin1，PSD93，PSD95和GluR1等突觸

8、蛋白以及APPβ，BACE1的變化。AAV-Vector、AAV-BACE1WT、AAV-BACE1K501R定位注射APP/PS1小鼠海馬，通過曠場、條件恐懼實驗來檢測行為學(xué)的變化，通過硫磺素染色觀察BACE1蘇木化修飾對Aβ斑塊形成的影響。原代海馬神經(jīng)元細胞給予0、40、400nM Aβ1-4224小時后，通過免疫印跡和免疫共沉淀方法檢測BACE1蘇木化修飾水平。最后，通過免疫印跡和免疫共沉淀方法檢測3、6、12月齡的APP/PS1

9、小鼠BACE1蘇木化修飾水平，通過激光共聚集熒光顯微鏡觀察BACE1和SUMO1共定位。
　　結(jié)果：同時轉(zhuǎn)染BACE1、SUMO-1、UBC9在HEK293T或N2A-APP細胞，通過免疫共沉淀方法檢測到BACE1和SUMO1結(jié)合，AAV-BACE1定位注射C57小鼠海馬，也檢測到在整體水平BACE1也可蘇木化修飾。在轉(zhuǎn)染了定點突變的BACE1K275R或K501R細胞株中，BACE1蘇木化修飾水平較野生型顯著降低，明確了K275

10、和K501是BACE1蘇木化修飾位點。我們觀察到，在轉(zhuǎn)染野生型或蘇木化位點突變BACE1的N2A-APP細胞中，轉(zhuǎn)染蘇木化位點突變的細胞APP的剪切、Aβ40/42水平顯著減少。我們還觀察到蘇木化位點的突變促進了BACE1的降解，降低了其酶的活性，但不改變轉(zhuǎn)錄水平。免疫熒光結(jié)果顯示：K501位點的BACE1的蘇木化修飾可調(diào)控其亞細胞定位，提高其穩(wěn)定性，并增加BACE1和APP的共定位。在小鼠海馬CA1區(qū)定位注射AAV-Vector、AA

11、V-BACE1野生型或蘇木化位點突變病毒感染動物1個月后，與對照組相比BACE1野生型組產(chǎn)生更為嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶障礙，蘇木化位點突變組較野生型組學(xué)習(xí)和記憶有顯著改善。免疫熒光、免疫印跡、高爾基染色結(jié)果也顯示，與對照組相比BACE1野生型組樹突和樹突棘密度以及突觸相關(guān)蛋白表達量顯著減少，但蘇木化位點突變組較野生型組有顯著改善。體外原代培養(yǎng)大鼠胚胎海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42可增加BACE1蘇木化修飾水平，并呈濃度依賴性。在APP/PS1小

12、鼠海馬中，我們也觀察到，隨著年齡的增加，BACE1蘇木化修飾水平也顯著提高。
　　結(jié)論：
　　1.在細胞和整體水平BACE1可以被蘇木化修飾，其修飾位點為K275和K501。
　　2.BACE1蘇木化修飾可以提高其蛋白穩(wěn)定性和酶的活性。
　　3.BACE1蘇木化修飾增加APPβ的剪切和Aβ的生成。
　　4.BACE1蘇木化修飾加劇神經(jīng)元樹突損傷及學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　5.BACE1蘇木化修飾水平與年齡存

13、在相關(guān)性。
　　第二部分 基于BACE1活性的抑制，兩種新化合物Terreterpenoids A和B緩解AD模型小鼠的Aβ毒性和學(xué)習(xí)記憶障礙
　　阿爾茨海默病（AD）是最常見的神經(jīng)退行性疾病，迄今為止，臨床尚無理想的治療藥物。Terreterpenoid A和B，是從土曲霉獲得的兩種具有碳骨架的新型萜類化合物，其結(jié)構(gòu)特征是壬烷碳骨架生物環(huán)[3.3.1]。通過X射線衍射技術(shù)鑒定了Terreterpenoid A的絕對結(jié)構(gòu)，并

14、通過電子圓二色性闡明Terreterpenoid B的絕對結(jié)構(gòu)。能量共振轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）發(fā)現(xiàn)Terreterpenoid A和B可以顯著降低β-分泌酶（BACE1）的活性，且IC50分別為78nM和59nM（陽性對照LY2811376=260nM，LY2811376是III期臨床試驗中最有效的BACE1抑制劑之一）。在3×TgAPP/PS1/P301L小鼠側(cè)腦室注射Terreterpenoid A后，BACE1的活性和Aβ42表達水