Nrf2缺失加劇DOX引起的心臟毒性和心功能障礙.pdf

1、背景：抗癌藥多柔比星（DOX，也稱阿霉素）是治療大部分癌癥的有效藥物。但是，由于它引起的劑量相關(guān)性急性和慢性心肌毒性極大地限制了化療用量。DOX引起的心肌毒性是多因素的，包括自由基引起的線粒體損傷、DNA損傷、抑制DNA和蛋白合成以及心肌纖維變性，這多種因素導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡和/或壞死。不過，其中的具體病理生理機(jī)制仍不完全明確。這其中占主導(dǎo)地位的假說是，氧化應(yīng)激是DOX誘發(fā)的心肌疾病的主要原因。但是，治療DOX相關(guān)的心肌病，非選擇性清除

2、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的抗氧化藥物是無效的。所以，更有效的治療手段需要針對(duì)氧化應(yīng)激來源或者內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)更加特異的靶點(diǎn);但是，這類特異性靶點(diǎn)仍待進(jìn)一步研究。NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor2， Nrf2)是一類轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控基礎(chǔ)以及誘導(dǎo)的抗氧化基因和細(xì)胞保護(hù)性Ⅱ相解毒酶的表達(dá)。研究已經(jīng)證明Nrf2在心功能衰竭和病理性重

3、塑過程中，是氧化應(yīng)激的負(fù)調(diào)控因子;同時(shí)，也有文獻(xiàn)報(bào)道Nrf2在硫化氫介導(dǎo)的氧化應(yīng)激引起的心功能衰竭中具有調(diào)節(jié)作用。因此，Nrf2可能是治療心肌細(xì)胞損傷和心衰的藥物靶點(diǎn)。有意思的是，最近有報(bào)道表明Nrf2能增加自噬清除因ROS而產(chǎn)生的毒性泛素化蛋白聚集體的能力，以此證明Nrf2能發(fā)揮激活有效自噬的調(diào)節(jié)作用。因此目前的研究，我們探討了心臟中Nrf2主要通過氧化應(yīng)激和自噬活性調(diào)節(jié)DOX誘發(fā)心肌疾病的作用。Nrf2功能的缺失會(huì)加重DOX引起的氧

4、化應(yīng)激、自噬活性缺陷以及心肌細(xì)胞壞死，從而引起心功能衰竭。這些結(jié)果說明Nrf2在DOX心肌疾病中是關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，從而為發(fā)現(xiàn)治療DOX心肌疾病的新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　目的：①探討在心臟中Nrf2主要通過氧化應(yīng)激和自噬活性調(diào)節(jié)DOX心肌疾病的作用。②Nrf2是DOX引起的心肌疾病中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控因子，從而發(fā)現(xiàn)了一類可能治療DOX引起的心肌疾病的新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：⑴構(gòu)建Nrf2敲除小鼠。⑵建立阿霉素心肌疾病模型

5、。⑶超聲檢測(cè)阿霉素心肌疾病小鼠的心功能情況。⑷測(cè)定體內(nèi)自噬流。⑸組織免疫學(xué)檢測(cè)氧化應(yīng)激標(biāo)志物和Nrf2表達(dá)。⑹Evans藍(lán)標(biāo)記壞死心肌組織。⑺制備Nrf2過表達(dá)和敲除以及Atg5過表達(dá)腺病毒。⑻新生大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)和腺病毒感染。⑼Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。⑽實(shí)時(shí)定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)基因表達(dá)。⑾應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：①單次腹腔注射DOX(25 mg/kg

6、)后，心臟中氧化應(yīng)激在第1天開始出現(xiàn)并維持到第4天，呈時(shí)間依賴性。同時(shí)，心臟中會(huì)出現(xiàn)大量的心肌細(xì)胞壞死，以心肌細(xì)胞的胞漿空泡化和散在的Evan藍(lán)染色為標(biāo)志。此外，DOX刺激4天引起收縮期左心室后壁厚度(LVPW;s)減少、收縮期和舒張期的左心室容積和FS％降低。②正常心臟中，給予抑制自噬小體與溶酶體融合的氯喹(chloroquine，CQ)，會(huì)引起心肌中LC3-Ⅱ和p62蛋白的增加，自噬流(autophagic flux)出現(xiàn)，說明自噬

7、活性是正常的。雖然DOX刺激后會(huì)引起小鼠心肌中LC3-Ⅱ和p62蛋白的增加，但給予CQ卻對(duì)它們沒有影響，說明DOX使自噬流受損。此外，DOX還會(huì)引起心臟中泛素化蛋白呈時(shí)間依賴性聚集。③DOX促進(jìn)了心臟中Nrf2 mRNA水平的表達(dá)，呈時(shí)間依賴性。DOX刺激4天后，心肌中Nrf2蛋白水平的表達(dá)也是增加的，并引起了Nrf2的核轉(zhuǎn)位。此外，DOX使Nrf2的下游抗氧化表達(dá)基因NQO1和HO-1 mRNA水平增加。④在心臟可溶性和不可溶性成分中

8、，Nrf2缺失增加DOX上調(diào)的LC3-Ⅱ和p62蛋白，說明Nrf2負(fù)調(diào)控DOX損傷的自噬流。Nrf2缺失并不影響可溶性成分中DOX引起的泛素化蛋白聚集，但增加不可溶性成分中泛素化蛋白的聚集。⑤DOX毒性劑量為1μM時(shí)，LC3-Ⅱ的水平增加;但使用自噬小體與溶酶體融合的抑制劑BafA1刺激，并不進(jìn)一步使DOX上調(diào)的LC3蛋白累積。此外，DOX(1μM)刺激使細(xì)胞中不可溶性成分中的泛素化蛋白聚集。Nrf2過表達(dá)上調(diào)而Nrf2敲掉下調(diào)LC3-

9、Ⅱ的水平。DOX刺激后，Ad-Gfp對(duì)照的細(xì)胞中LC3-Ⅱ水平累積，而Ad-Nrf2感染的細(xì)胞沒有變化。相反，DOX使Ad-scramble對(duì)照組和Ad-miNrf2感染的細(xì)胞中LC3-Ⅱ水平呈相等程度累積。Nrf2過表達(dá)顯著抑制了DOX引起的泛素化蛋白聚集體蓄積;而Nrf2敲掉增加了基礎(chǔ)和DOX引起的泛素化蛋白聚集體蓄積。
　　結(jié)論：⑴Nrf2可能是DOX引起的心肌疾病中內(nèi)源性抑制因子。其中的機(jī)制可能是Nrf2能抑制DOX引起的