迷走復(fù)合體注射ghrelin激活弓狀核NPY-AgRP神經(jīng)元而誘發(fā)多食.pdf

1、背景資料：Kojima等人在1999年純化了一個由28個氨基酸組成的肽，該肽是生長素促分泌物受體(growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)的激動劑，被命名為“Ghrelin”。該分子在絲氨酸殘端含有一個辛?；@一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是Ghrelin發(fā)揮其生物活性所必須的。Ghrelin主要由胃的內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生，然后釋放入外周血液循環(huán)，同時(shí)在下丘腦的弓狀核及臨近第三腦室的神經(jīng)元中相繼被發(fā)現(xiàn)。Ghreli

2、n可與GHS-R結(jié)合促進(jìn)生長素的分泌，同時(shí)還具有促進(jìn)攝食、增加體重，參與體重和能量穩(wěn)態(tài)的長期調(diào)節(jié)作用。許多研究表明，ghrelin具有啟動攝食的生理作用，Ghrelin促進(jìn)食欲的作用機(jī)制，尤其是Ghrelin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervous system，CNS)的作用位點(diǎn)，成為關(guān)注的焦點(diǎn)。目前絕大多數(shù)研究證實(shí)，Ghrelin刺激攝食的作用靶點(diǎn)是下丘腦弓狀核(arcuate nucleus，ARC)“神經(jīng)肽Y(neurope

3、ptide Y，NPY)/刺鼠色蛋白相關(guān)蛋白(agouti-related peptide，AgRP)”神經(jīng)元，藥理學(xué)試驗(yàn)證據(jù)也表明了ghrelin促進(jìn)攝食作用主要是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)NPY/AgRP所介導(dǎo)。此為Ghrelin誘發(fā)多食反應(yīng)的前腦機(jī)制。盡管有很多證據(jù)支持ghrelin的主要作用靶點(diǎn)是下丘腦的ARC，但J.M.Zigman等采用原位雜交的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在腦干迷走復(fù)合體(dorsal vagal complex，DVC)的三個組成部

4、位(孤束核、最后區(qū)、迷走神經(jīng)運(yùn)動背核)均有GHS-R的存在。Faulconbridge等報(bào)道在第三腦室和第四腦室注入ghrelin(150p mol)引起幾乎相同程度的攝食增加，而且DVC單側(cè)微量注射ghrelin(10p mol)3h后引起攝食增加的程度與ARC注射Ghrelin(30pmol)所引起的攝食增加程度是一樣的。由此推斷，Ghrelin還可能通過腦干機(jī)制發(fā)揮作用，那么腦干DVC注射ghrelin促進(jìn)攝食的機(jī)制是什么呢?這有

5、待于我們做進(jìn)一步的探討。
　　 目的：探討作用于DVC的Ghrelin是否也是通過弓狀核NPY/AgRP神經(jīng)通路最終促進(jìn)攝食活動?以進(jìn)一步明確DVC Ghrelin誘發(fā)攝食的腦干機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.攝食測定選擇健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(250g～300g)32只，隨機(jī)分成2組，Ghrelin組(n=16，DVC注射20pmol Ghrelin)和生理鹽水組(n=16，DVC注射

6、0.5μl無菌生理鹽水)。各組大鼠先行DVC埋管手術(shù)，術(shù)后恢復(fù)7d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前3天注射3次生理鹽水以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。采用自動攝食分析儀(Feeding and Activity Analyser47552-002，UGO BASILE，ITALY)分別測定大鼠DVC微量注射Ghrelin(或生理鹽水)20 pmol后1h、2h、3h和4h累積攝食量的變化。
　　 2.熒光定量PCR測定下丘腦弓狀核NPY/AgRP mRNA的表

7、達(dá)72只雄性SD大鼠隨機(jī)分成2大組，即Ghrelin組和對照(生理鹽水)組，每組又根據(jù)注射后檢測間隔時(shí)間的不同隨機(jī)分為三個亞組，即1小時(shí)(1h)組、2小時(shí)(2h)組、3小時(shí)(3h)組，每組各12只大鼠。各組大鼠先行DVC埋管手術(shù)，術(shù)后恢復(fù)7d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前3天注射3次生理鹽水以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。Ghrelin組DVC微量注射20pmolghrelin，對照組DVC微量注射等體積生理鹽水。每組分別于注射后1h、2h、3h取大鼠下丘腦弓狀核提

8、取RNA，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測不同組別大鼠下丘腦弓狀核NPY/AgRP mRNA的表達(dá)水平。
　　 3.免疫組化檢測NPY神經(jīng)元的表達(dá)16只雄性SD大鼠隨機(jī)分成2組，Ghrelin組和生理鹽水組(每組n=8)，各組大鼠先行DVC埋管手術(shù)，術(shù)后恢復(fù)7d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前3天注射3次生理鹽水以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。Ghrelin組DVC微量注射20pmol ghrelin，對照組微量注射等體積生理鹽水。每組大鼠分別于注射后1h、2h

9、、3h斷頭取腦，冰凍切片進(jìn)行免疫組化染色，鏡下觀察下丘腦弓狀核NPY免疫陽性神經(jīng)元的染色情況，并通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算NPY陽性神經(jīng)元數(shù)量及光密度。
　　 結(jié)果：
　　 Ghrelin組大鼠1h、2h、3h的累積攝食量明顯高于鹽水組[1h：(0.92±0.99)g vs(0.61±0.13)g，P<0.05；2 h：(2.03±0.10)g vs(1.21±0.17)g，P<0.01；3 h：(2.38±0.11)g vs(

10、1.62±0.19)g，P<0.05]，2h的累積攝食量達(dá)高峰，注射后4h Ghrelin組大鼠的累積攝食量與鹽水對照組無顯著性差異。
　　 Ghrelin組1h、2h、3h大鼠下丘腦弓狀核NPY/AgRP mRNA的表達(dá)水平明顯高于鹽水對照組NPY/AgRP mRNA的表達(dá)水平(t=2.79～9.12，P<0.05，0.01)，其中NPY mRNA的表達(dá)水平比鹽水對照組分別增高238.09％，648.84％和156.82％，而

11、AgRP mRNA的表達(dá)水平比鹽水對照組分別增高161.45％，576.82％和121.30％。Ghrelin注射后2h NPY/AgRP mRNA的表達(dá)水平明顯高于1h及3h組的表達(dá)水平(F=16.55，10.45；q=5.28～7.46，P<0.05，0.01)，但1h組與3h組下丘腦弓狀核NPY/AgRP mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(q=0.56，1.04；P>0.05)。
　　 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Ghrelin注射后1

12、h、2h、3h下丘腦弓狀核NPY免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)量及平均光密度分別高于鹽水對照組(1h、3h，P<0.05；2 h，P<0.01)，2h分別達(dá)到最高值，而1h與3h間NPY免疫陽性神經(jīng)元的數(shù)量及平均光密度均無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.Ghrelin可作用于腦干DVC的GHS-R，通過上行纖維引起下丘腦弓狀核NPY/AgRP mRNA的表達(dá)增加。
　　 2.下丘腦弓狀核NPY/AgRP神經(jīng)元的激活參與了