肺炎克雷伯菌生物膜形成與外排泵基因的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　本課題擬探討肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與耐藥的相關(guān)性，多重耐藥肺炎克雷伯菌外排泵基因的分布情況以及外排泵基因acrA在生物膜內(nèi)的表達(dá)情況，以及外排泵抑制劑羰酰氰間氯苯腙(carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP)對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成影響。深入了解肺炎克雷伯菌生物膜耐藥機(jī)制，為有效防控肺炎克雷伯菌感染提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)

2、院2017年1月至2017年6月臨床感染患者樣本中分離的61株非重復(fù)肺炎克雷伯菌。利用MicroScan WalkAway96Plus全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，對(duì)標(biāo)本來(lái)源和科室分布進(jìn)行分析，并分析其耐藥譜。2.結(jié)晶紫染色法和共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)法評(píng)價(jià)肺炎克雷伯菌形成生物膜能力，分析肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的強(qiáng)弱與耐藥的相關(guān)性。3.隨機(jī)抽取1

3、6株生物膜形成能力不同的菌株，繪制肺炎克雷伯菌生物膜生長(zhǎng)曲線，微量肉湯稀釋法檢測(cè)這16株菌對(duì)頭孢吡肟、阿米卡星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、多粘菌素B最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)以及最低生物膜清除濃度(Minimal biofilm eradicate concentration，MBEC)，分析MIC、MBEC與其生物膜形成能力的相關(guān)性。4.用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Ch

4、ain Reaction，PCR)技術(shù)檢測(cè)28株多重耐藥肺炎克雷伯菌外排泵基因acrA、emrB、oqxA、qacE△1攜帶情況，并運(yùn)用(reversetranscription-PCR，RT-PCR)技術(shù)分析acrA基因陽(yáng)性菌株在生物膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)的表達(dá)情況。5.結(jié)晶紫染色法分析不同濃度的外排泵抑制劑CCCP對(duì)肺炎克雷伯菌生物膜形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.61株肺炎克雷伯菌臨床分離菌株中，主要來(lái)自于血液34株，占5

5、5.74％，其次是痰16株，占26.22％，分泌物8株，占13.11％，尿液3株，占4.92％。臨床科室分布以ICU病房檢出率最高，為21.31％，其次是呼吸科病房，檢出率為13.11％。檢出多重耐藥肺炎克雷伯菌(Multi-drug resistant acinetobacter klebsiella pneumoniae，MDR-Kpn)28株，檢出率為45.9％(28/61)，非多重耐藥菌33株，檢出率54.1％(33/61)。M

6、DR-Kpn對(duì)包括氨芐西林、頭孢唑林等13種抗菌藥物耐藥率在50％以上，僅對(duì)美羅培南，亞胺培南，厄他培南，阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率低。將MDR-Kpn(n=28)與非MDR-Kpn(n=33)兩組對(duì)23種抗菌藥物的耐藥率進(jìn)行比較，MDR-Kpn對(duì)除氨芐西林、美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦外的17種抗菌藥物的耐藥率均明顯高于非MDR-Kpn菌株(P＜0.05)。2.61株菌中，只有Kpn216、Kpn22

7、5兩株菌不能形成生物膜，生物膜陽(yáng)性率為96.72％，其中，生物膜強(qiáng)陽(yáng)性的14株，陽(yáng)性27株，弱陽(yáng)性18株，多重耐藥菌與非多重耐藥菌生物膜形成能力無(wú)明顯差異(P＞0.05)。3.隨機(jī)選擇生物膜形成能力強(qiáng)的8株菌和生物膜形成能力弱的8株菌，檢測(cè)生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌之間生長(zhǎng)率的差異不明顯，說(shuō)明肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的不同并非由于細(xì)菌生長(zhǎng)率的不同造成。定量檢測(cè)16株菌對(duì)頭孢吡肟、阿米卡星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、多粘菌素B的最低抑菌濃度以及最低生

8、物膜清除濃度，結(jié)果是Kpn形成生物膜后，對(duì)不同抗菌藥物的耐藥能力均有所增長(zhǎng)，對(duì)頭孢吡肟，MIC為4-64ug/ml，MBEC為320-2560ug/ml，增幅為20-640倍。對(duì)阿米卡星，MIC為1-16ug/ml，MBEC為80-5120ug/ml，增幅為40-5120倍。對(duì)環(huán)丙沙星，MIC為0.25-8ug/ml，MBEC為40-5120ug/ml，增幅為80-5120倍。對(duì)亞胺培南，MIC為0.25-16ug/ml，MBEC為16

9、0-2560ug/ml，增幅為80-5120倍。對(duì)多粘菌素B，MIC為0.5-2ug/ml，MBEC為2-512ug/ml，增幅為4-512倍。經(jīng)過(guò)分析，不同菌株MIC值與MBEC值對(duì)頭孢吡肟(r=0.628，p=0.01)、環(huán)丙沙星(r=0.81，p=0.0001)存在正相關(guān)性，即菌株MIC值越大，形成生物膜后的MBEC值越大。對(duì)多粘菌素B(r=0.319，p=0.229)，阿米卡星(r=0.441，p=0.088)和亞胺培南(r=0

10、.079，p=0.769)并無(wú)相關(guān)性。4.28株MDR-Kpn外排泵基因的檢測(cè)中，emrB基因陽(yáng)性25株，陽(yáng)性率最高，為89.29％，其次是oqxA基因陽(yáng)性22株，陽(yáng)性率為78.57％，qacE△1基因陽(yáng)性11株，陽(yáng)性率39.29％，acrA基因陽(yáng)性10株，陽(yáng)性率35.71％。28株菌只Kpn215未檢出外排泵基因，只攜帶一種外排泵基因的有4株，占14.29％，同時(shí)攜帶2種外排泵基因的有8株，占28.57％，同時(shí)攜帶3種外排泵基因的有1

11、2株，占42.86％，同時(shí)攜帶4種外排泵基因的有5株，占17.86％。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，菌株攜帶外排泵基因種類的多少與其生物膜形成能力并無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)，4種外排泵基因陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后與GenBank中的已提交的相應(yīng)基因序列的同源性均≥98％。5.隨機(jī)選取6株acrA基因陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌，對(duì)比生物膜狀態(tài)與浮游狀態(tài)下acrA基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)生物膜狀態(tài)下acrA基因表達(dá)存在不同程度的上調(diào)，最高上調(diào)倍數(shù)達(dá)78倍。證明生物膜的形成

12、能夠促進(jìn)外排基因acrA的表達(dá)。6.當(dāng)外排泵抑制劑CCCP濃度在1.25-10μg/ml時(shí)，能夠不同程度促進(jìn)肺炎克雷伯菌生物膜形成。
　　結(jié)論：
　　1.多重耐藥肺炎克雷伯菌檢出率較高，MDR-Kpn僅對(duì)美羅培南、亞胺培南、厄他培南、阿米卡星和頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率低，能夠作為肺炎克雷伯菌感染的治療用藥。2.肺炎克雷伯菌生物膜陽(yáng)性檢出率高，多重耐藥菌與非多重耐藥菌生物膜形成能力無(wú)明顯差異，肺炎克雷伯菌形成生物膜后的耐藥能力