脂肪氧合酶催化亞油酸誘導(dǎo)大豆蛋白聚集機(jī)理.pdf

1、各種大豆蛋白均以脫脂大豆為原料制備，但脫脂豆粕中殘留的不飽和脂質(zhì)容易在脂肪氧合酶的催化下發(fā)生氧化，且脂質(zhì)-蛋白質(zhì)體系中的氧化脂質(zhì)易誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集，從而引起蛋白質(zhì)的營養(yǎng)和功能性質(zhì)發(fā)生不期望的變化。因大豆蛋白聚集而涉及的內(nèi)容很多，本文重點(diǎn)研究由脂肪氧合酶催化亞油酸誘導(dǎo)大豆蛋白聚集的機(jī)理。 通過建立由亞油酸、脂肪氧合酶和低脂質(zhì)含量的大豆蛋白所組成的模擬反應(yīng)體系，應(yīng)用化學(xué)分析、電泳、凝膠色譜和激光光散射等方法研究了反應(yīng)后大豆蛋白的聚集情

2、況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在模擬體系中同時(shí)添加亞油酸和脂肪氧合酶會使反應(yīng)后樣品的混濁度與表面疏水性增加，巰基與二硫鍵的含量下降。SDS-PAGE顯示大豆蛋白7S和11S的各個(gè)亞基均參與了反應(yīng)，尤其是7S部分反應(yīng)更為明顯，表明聚集體的形成涉及包括二硫鍵在內(nèi)的共價(jià)交聯(lián)。原態(tài)電泳、凝膠色譜和激光光散射分析進(jìn)一步證實(shí)，反應(yīng)后的大豆蛋白形成了相對高分子質(zhì)量和顆粒粒徑較大的聚集體。 采用熒光光譜結(jié)合蛋白質(zhì)氧化值、氨基酸組成、TBA值、GC-MS和可溶蛋

3、白質(zhì)的表面疏水性等分析，探討了脂肪氧合酶催化亞油酸氧化與大豆蛋白的相互作用。在脂肪氧合酶的催化作用下，亞油酸氧化產(chǎn)生的氫過氧化物及其降解產(chǎn)物與大豆蛋白作用，反應(yīng)后大豆蛋白的熒光光譜最大激發(fā)波長在350nm，最大發(fā)射波長在440nm。脂肪氧合酶催化亞油酸氧化與大豆蛋白的相互作用，在LRSP+LA+LOX模擬體系中產(chǎn)生熒光物質(zhì)。該熒光物質(zhì)部分可溶于氯仿-甲醇溶液的有機(jī)相中，其熒光光譜最大激發(fā)波長在350nm，最大發(fā)射波長在430nm，且熒光

4、強(qiáng)度隨著反應(yīng)程度的增加而增強(qiáng)。伴隨著熒光物質(zhì)的形成，反應(yīng)后大豆蛋白的蛋白質(zhì)氧化值增加，可溶性蛋白質(zhì)的表面疏水性降低，色氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸和半胱氨酸(胱氨酸)等氨基酸含量減少，蛋白質(zhì)分子間形成C-C或C-N形式的共價(jià)交聯(lián)并進(jìn)一步導(dǎo)致大豆蛋白聚集。 導(dǎo)致大豆蛋白聚集體形成的自由基由氧化亞油酸到大豆蛋白的遷移以及部分自由基類型的確定是通過電子順磁共振(EPR)研究完成的。經(jīng)脂肪氧合酶催化亞油酸的誘導(dǎo)，在大豆蛋白EPR

5、波譜中檢測到一個(gè)很強(qiáng)的源于肽鏈骨架α-碳原子或其側(cè)鏈其它碳原子的自由基信號，其g值范圍在2.0041-2.0054之間。此外，在碳自由基中場信號的低場區(qū)尚有一個(gè)額外的肩峰，它是硫自由基信號，其g值范圍在2.019-2.028之間。在大豆蛋白發(fā)生上述變化的同時(shí)伴隨著熒光強(qiáng)度的增加，表明蛋白分子之間和/或之內(nèi)產(chǎn)生了共價(jià)交聯(lián)。在大豆蛋白與脂肪氧合酶和亞油酸混合反應(yīng)前，添加抗氧化劑能抑制自由基信號和熒光的發(fā)展；可使中場碳自由基信號降低35-65

6、％。除了上述提及的自由基之外，通過改變微波功率測量EPR波譜，又確定了兩種類型的自由基。具有較高反應(yīng)活性的羥基自由基(·OH)源于自由基鏈反應(yīng)和水分子；醛自由基源于大豆蛋白與脂肪氧合酶催化亞油酸氧化產(chǎn)生的降解產(chǎn)物的酶促反應(yīng)。 應(yīng)用傅立葉變換紅外、激光拉曼和圓二色性光譜等方法研究了不同亞油酸濃度下脂肪氧合酶催化誘導(dǎo)產(chǎn)生的大豆蛋白聚集體的結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)模擬反應(yīng)體系中亞油酸濃度在3.14-6.09mmol/L范圍之間時(shí)，拉曼光譜中歸屬于

7、CH和CH2彎曲振動的譜帶強(qiáng)度增強(qiáng)，而歸屬于位于非極性環(huán)境中的色氨酸和酪氨酸殘基的譜帶強(qiáng)度減弱；當(dāng)亞油酸濃度達(dá)到7.51mmol/L時(shí)，又觀察到相反的結(jié)果，這表明大豆蛋白質(zhì)的聚集涉及疏水相互作用。此外，在蛋白質(zhì)拉曼光譜中還觀察到胱氨酸殘基二硫鍵的伸縮振動變化。紅外光譜分析表明，在模擬反應(yīng)體系中，通過氫鍵形成的分子間β-折疊結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和聚集體形成中發(fā)揮著重要的作用。二級結(jié)構(gòu)分析表明，反應(yīng)后大豆蛋白α-螺旋減少，β-折疊增

8、加，這在紅外和拉曼光譜中已有明顯的反映，而在圓二色性光譜分析中進(jìn)一步得到證實(shí)。 通過模擬大豆蛋白質(zhì)制備過程，探討了脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對酸沉大豆蛋白部分性質(zhì)的影響。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)后大豆蛋白等電點(diǎn)聚集沉淀的顆粒更加規(guī)整致密。毛細(xì)管電泳分析表明，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酸沉大豆蛋白各亞基的遷移時(shí)間延長、峰形展寬。紫外可見光譜分析證實(shí)，經(jīng)不同時(shí)間反應(yīng)后的大豆蛋白，其生色基團(tuán)所處微環(huán)境發(fā)生了改變。SEC-HPLC和LLS分析表明，酸沉大

9、豆蛋白的相對分子質(zhì)量和流體力學(xué)體積隨反應(yīng)時(shí)間延長而增加，且粒徑分布具有多態(tài)性。酸沉大豆蛋白溶液的特性粘度也隨反應(yīng)時(shí)間延長而增加。這些數(shù)據(jù)說明模擬反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)聚集行為和聚集程度隨反應(yīng)時(shí)間的不同而不同。 基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，由脂肪氧合酶催化亞油酸誘導(dǎo)大豆蛋白聚集的機(jī)理主要包括以下幾個(gè)方面：(1)是中間產(chǎn)物自由基導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的聚合，即亞油酸過氧化初級產(chǎn)物(主要是氫過氧化物)的裂解產(chǎn)生脂質(zhì)自由基，脂質(zhì)自由基作為引發(fā)劑通過