兩個與抗病、抗逆和發(fā)育相關(guān)的擬南芥激發(fā)標簽突變體asr1和dai1的研究.pdf

1、植物的生長發(fā)育與其所處的環(huán)境息息相關(guān),在各種環(huán)境因素中,逆境對植物的影響尤為重要.逆境通常包括生物逆境和非生物逆境,前者是指病原微生物、昆蟲以及雜草等對植物的危害,后者是指高鹽、干旱、澇害、低溫和高溫等對植物的影響,兩者相加是造成世界上主要經(jīng)濟作物產(chǎn)量損失的主要因素.因此,在分子水平上研究植物對生物脅迫和非生物脅迫的適應(yīng)機制不僅有著重要的理論意義,而且還具有重大的經(jīng)濟價值.激發(fā)標簽技術(shù)是建立在功能獲得突變基礎(chǔ)之上的一項突變體庫構(gòu)建技術(shù),

2、它在分離和研究基因家族的基因、性狀不易檢測的基因以及性狀由QTL(Quantitativetraitloci)控制的基因等方面具有獨特的優(yōu)勢.此外,激發(fā)標簽技術(shù)得到的突變體通常為顯性遺傳,其表型可在轉(zhuǎn)基因的T<,1>代表現(xiàn)出來,為目的突變體的篩選帶來了很大的便利.因此,利用激發(fā)標簽技術(shù)構(gòu)建模式植物擬南芥的突變體庫,從中篩選與逆境脅迫相關(guān)的突變體,克隆并研究相關(guān)基因的功能具有很大的成功可能性和良好的應(yīng)用前景.該文以擬南芥(Arabidop

3、sisthaliana)為實驗材料,以激發(fā)標簽為技術(shù)平臺,構(gòu)建了擬南芥的功能獲得突變體庫,從中篩選具有抗病、抗逆表型的突變體,克隆基因并進行基因的功能研究,取得的主要結(jié)果如下:(1)利用含激發(fā)標簽質(zhì)粒pSKI015的農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化擬南芥植株,以抗除草劑的Bar基因為篩選標記,獲得了約有12 000個獨立轉(zhuǎn)化株系的突變體庫,并從中篩選到2個與抗病、抗逆和發(fā)育相關(guān)的突變體asr1(auxin and salicylic acid respo

4、nsive 1)和dail(droughttolerant and abscisic acid insensitive 1).(2)通過質(zhì)粒拯救克隆到了ASR1基因,并在野生型擬南芥Col-0中進行了轉(zhuǎn)基因驗證.ASR1屬于生長素相關(guān)的GH3基因家族,它編碼的蛋白質(zhì)在突變體內(nèi)過量表達,并造成植株矮化,蓮座葉片向下卷曲,側(cè)根發(fā)生受到抑制等形態(tài)表型的改變,同時,ASR1可能還參與了植物體對抗病信號分子水楊酸的調(diào)控或修飾過程,并使asrl突變

5、體對病原菌丁香假單胞桿菌的侵染更敏感.(3)構(gòu)建了ASR1的原核表達載體并在大腸桿菌中進行了高效表達,得到了相應(yīng)的多克隆抗體.Western雜交的結(jié)果表明,與野生型相比,ASR1基因不僅在轉(zhuǎn)錄水平上超表達,而且在翻譯的水平上也超表達,并且純合子的表達豐度高于雜合子.此外,還構(gòu)建了ASR1與GFP(綠色熒光蛋白)融合蛋白的表達載體pCAM-ASR1-GFP,洋蔥表皮瞬時表達系統(tǒng)顯示ASR1:GFP融合蛋白主要定位于細胞壁中.(4)對dai