Gbx2維持及誘導小鼠胚胎干細胞na-ve多能性的分子機制探究.pdf

1、小鼠胚胎干細胞(mouse Embryonic Stem Cells，mESCs)是分離自著床前囊胚期內(nèi)細胞團的細胞(Inner cell mass，ICM)，在體外培養(yǎng)具有無限自我復制式增殖的能力，簡稱自我更新(Self-renewal)，以及多向分化的潛能，簡稱多能性(Pluripotency)。小鼠的ESCs注射到囊胚中具有形成嵌合體動物的能力，這種發(fā)育狀態(tài)稱為Na(i)ve或者Ground多能性狀態(tài)。而小鼠的上胚層干細胞(mou

2、se Epiblast Stem Cells，mEpiSCs)與人胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)在注射到囊胚后不能形成完整的嵌合胚胎。hESCs和mEpiSCs的這種相似的發(fā)育狀態(tài)稱為Primed多能性狀態(tài)。小鼠和人的ESCs需要不同的培養(yǎng)條件來維持其多能性狀態(tài)。通過在培養(yǎng)體系中加入相應地小因子、生長因子或細胞因子來激活或抑制細胞內(nèi)的信號通路，從而能夠維持ESC的自我更新和多能性。

3、　　無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中加入血清(serum)和細胞因子LIF(Leukemia Inhibitory Factor)可以在體外長期維持mESCs的自我更新和多能性。LIF作為胞外信號，主要通過激活細胞內(nèi)的JAK(Janus kinase)/STAT3(Signal Transducer and Activator of Transcription3)信號通路，從而激活下游相關轉錄因子表達來維持mESCs的Naive多能性狀態(tài)。一些LIF

4、/STAT3信號通路的下游靶基因己被篩選并鑒定出來，例如Gbx2，Klf4，Sps和5和Tfcp2l1等。然而，這些基因在促進mESC自我更新方面的機制仍不清楚。
　　轉錄因子Gbx2(Gastrulation brain homeobox2)，即原腸胚形成和腦特異性同源蛋白框2，被證明是LIF/STAT3信號通路的直接下游靶基因。過表達Gbx2的小鼠胚胎干細胞能夠在無LIF的血清培養(yǎng)基質(zhì)中長期維持自我更新和多能性;并且過表達Gb

5、x2還能夠促進mEpiSCs重編程為類似于小鼠胚胎干細胞(mESCS-like)的Na(i)fve多能性狀態(tài)。但是，關于過表達的Gbx2如何替代LIF維持胚胎干細胞自我更新和多能性的分子機制，目前在國內(nèi)外并未有相關報道。也就是說，LIF/STAT3信號通路中，Gbx2激活哪些關鍵的下游基因來發(fā)揮作用呢？為探究該問題，本課題首先進行了Gbx2靶基因的篩選和鑒定。利用PiggyBac(PB)載體系統(tǒng)轉染的方法，在46C小鼠胚胎干細胞中過表達

6、Gbx2(PB-Gbx2)，對照組轉染PB空載體，然后通過RNA-Seq結合生物信息學分析的方法對Gbx2候選靶基因進行初步篩選，包括顯著性基因表達聚類分析、GO(Gene Ontology)功能分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析干細胞多能性信號通路相關的基因。qRT-PCR初步驗證結果顯示，相比于對照組PB mESCs，PB-Gbx2mESCs中Klf4，Nanog的m

7、RNA表達水平增加了約2.0fold以上。為了進一步探宄Gbx2對Nanog和Klf4表達的調(diào)控作用，我們從以下三個方面入手。首先，正常LIF/serum培養(yǎng)PB和PB-Gbx2mESCs，撤掉LIF1h到24h，熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測結果顯示:過表達的Gbx2能夠抑制LIF的撤除所導致的Klf4下調(diào)，卻不能抑制Nanog下調(diào)。其次，加入4-OHT(4-hydroxytamoxifen)誘導Gbx2-ERT2mESCs中G

8、bx2的激活，qRT-PCR結果顯示:隨著4-OHT加入時間的增加(0-120minutes)，Klf4的表達也明顯上調(diào)，而Nanog的表達無明顯趨勢。最后，在mESCs中下調(diào)Gbx2的表達，qRT-PCR結果顯示只有Klf4的表達顯著降低。以上結果表明，Klf4是Gbx2調(diào)控的下游基因。為了進一步證明Klf4是否為Gbx2直接調(diào)控的靶基因，本課題從JASPAR核心數(shù)據(jù)庫(the JASPAR CORE database)在線分析和預測

9、Gbx2在Klf4啟動予(Promoter)上的結合位點(binding motifs)。之后通過對PB-Gbx246C mESCs進行染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)并檢測Klf4啟動子序列所控制且由Gbx2所激活的熒光素酶的活性，數(shù)據(jù)證明了Klf4是Gbx2的直接靶基因。
　　以上結果驗證了Klf4是Gbx2的直接靶基因，那么Gbx2在功能上是否依賴靶基因Klf4的表達呢？因此，本課題后期主要針對靶基因Klf4對Gbx2促進自我更

10、新和重編程功能兩方面的影響進行探究。該部分研究結果如下:1.堿性磷酸酶染色及多能性標志基因NANOG蛋白的免疫熒光染色等數(shù)據(jù)顯示，在過表達Gbx2的小鼠46C胚胎干細胞中將Klf4的表達敲低，Gbx2的過表達維持mESC自我更新和多能性的功能顯著降低，即:靶基因Klf4介導了Gbx2的促自我更新效應。2.在CD1mEpiSCs中過表達Gbx2，并knockdown靶基因Klf4的表達，與對照組相比，該細胞克隆出現(xiàn)明顯的死亡或分化。因此，

11、Klf4的下調(diào)消除了Gbx2促進mEpiScs重編程的效應。由此我們得出結論:對于Gbx2促進mEpiSCs重編程為Na(i)ve多能性狀態(tài)效率的能力，靶基因Klf4也是至關重要的。
　　綜上所述，本課題揭示了LIF/STAT3信號通路中轉錄因子Gbx2維持和誘導小鼠胚胎干細胞Na(i)ve多能性狀態(tài)的分子機制:Gbx2直接調(diào)控靶基因Klf4的轉錄表達來維持小鼠胚胎干細胞的自我更新以及促進小鼠上胚層干細胞重編程到類似小鼠胚胎干細胞