HGF基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞治療閉塞性細(xì)支氣管炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、同種異體移植已經(jīng)成為血液系統(tǒng)惡性病的主要治療方法，盡管新的治療方法和免疫抑制劑的使用對(duì)于感染并發(fā)癥有很好的控制作用，但肺部并發(fā)癥仍是造血干細(xì)胞移植后發(fā)病率和死亡率高的主要原因。閉塞性細(xì)支氣管炎(Bronchiolitis obliterans syndrome，BOS)是一種嚴(yán)重的、非感染性的、致命的肺部并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制可能與慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease，cGVHD)相關(guān)，目前

2、尚無(wú)有效治療手段，因此，研發(fā)新的治療策略具有重要意義。
　　近年的研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Hepatocyte growth factor，HGF）是一種多功能生長(zhǎng)因子。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型中，通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1(Transformating growth factor-beta1，TGF-β1)的分泌，發(fā)揮抗纖維化、抗炎的作用，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，減少纖維蛋白的沉積。但是，HGF蛋白的半衰期短，需要

3、多次給藥，靜脈給藥不能大量進(jìn)入肺組織，因而不能更好地發(fā)揮效能。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）作為一種多能干細(xì)胞，不僅具有免疫調(diào)節(jié)和多向分化潛能，還具有相對(duì)的定位歸巢作用，容易歸巢到炎癥、損傷部位。本課題組前期試驗(yàn)證實(shí)重組腺病毒-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Recombinant adenovirus with HGF，Ad-HGF)修飾可使人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical Cord Mesenchymal

4、 stem cells，UCMSC)可高表達(dá)HGF,延長(zhǎng)UCMSC在小鼠體內(nèi)存活時(shí)間，增強(qiáng)UCMSC的免疫調(diào)節(jié)作用，有效治療放射性肺損傷和腸損傷?；蛐揎椀母杉?xì)胞因具有干細(xì)胞治療和基因治療的雙重優(yōu)勢(shì)，在基因生物治療領(lǐng)域已得到廣泛的認(rèn)同及關(guān)注。
　　本實(shí)驗(yàn)采用HGF基因修飾的UCMSC治療閉塞性細(xì)支氣管炎，觀察移植氣管病理學(xué)變化，計(jì)算移植氣管的阻塞率，評(píng)估HGF基因修飾的UCMSC對(duì)防治閉塞性細(xì)支氣管炎的療效，通過(guò)檢測(cè)移植氣管組織及

5、血清中炎性因子的表達(dá)、脾臟中淋巴細(xì)胞表型的變化來(lái)研究基因修飾細(xì)胞的作用機(jī)制。
　　首先，按Hertz等人建立的方法建立了小鼠異位氣管移植模型。為評(píng)價(jià)MSC在BOS小鼠體內(nèi)的定植分布情況，我們分離、培養(yǎng)及鑒定EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse bone marrowmesenchymal stem cells，BMSC)后，建立異種氣管異位移植的BOS小鼠模型。待小鼠蘇醒后，通過(guò)尾靜脈輸注經(jīng)150MOI Ad-Null

6、或Ad-HGF感染的mBMSC（1×106細(xì)胞/200μl），在注射后不同的時(shí)間點(diǎn)，眼球取血，對(duì)移植氣管、重要臟器進(jìn)行取材并提取基因組DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR，Q-PCR)的方法檢測(cè)EGFP基因在BOS小鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。將經(jīng)150MOI Ad-Null或Ad-HGF感染的UCMSC細(xì)胞作為治療用細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈輸注于BOS模型鼠（1×106細(xì)胞/200μl），對(duì)照組輸注200μL生

7、理鹽水(Normal saline，NS)，通過(guò)設(shè)立不同時(shí)間點(diǎn)及組別，收集移植氣管固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片、H&E染色，觀察移植氣管纖維結(jié)締組織的增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理形態(tài)變化，從而評(píng)價(jià)UCMSC對(duì)小鼠BOS的治療作用及HGF基因修飾對(duì)療效的影響。此外，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)和Q-PCR的方法，檢測(cè)了血液及移植局部炎癥因子及抗炎因子的表達(dá)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

8、脾臟淋巴細(xì)胞表型改變。
　　研究結(jié)果表明，BMSC移植后可以歸巢并定植于移植氣管損傷局部、血液、肝臟、肺等組織器官，HGF基因修飾可以促進(jìn)BMSC的定植并延長(zhǎng)其定植時(shí)間。MSCs-HGF及MSCs-Null治療可以明顯減輕移植氣管內(nèi)纖維結(jié)締組織的增生、上皮細(xì)胞的壞死、脫落、缺失、炎細(xì)胞的浸潤(rùn)、氣管環(huán)的破壞等BOS典型的病理變化，HGF基因修飾組作用優(yōu)于MSCs-Null組。MSCs-HGF治療后炎性細(xì)胞因子γ-干擾素(gamaIn

9、terferon，IFN-γ)表達(dá)降低，抗炎細(xì)胞因子白介素-4(Interleukin4，IL-4)和白介素-10(Interleukin10，IL-10)的表達(dá)升高，同時(shí)促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)水平降低。此外，細(xì)胞治療后降低了由氣管移植所誘導(dǎo)的脾臟淋巴細(xì)胞Treg，Th1/Th2，Th17的升高趨勢(shì)，細(xì)胞免疫表型改變明顯改善。
　　上述研究表明，HGF修飾的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以防止氣管移植相關(guān)的氣道纖維增生性病變，可通過(guò)調(diào)