基于納米技術的高通量自動化單堿基差異檢測方法研究.pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是人類基因序列中最常見的變異，也是醫(yī)學診斷或生物信息與疾病及藥效關聯(lián)的研究重點，對其研究有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對復雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因子的反應等，對其研究為新藥開發(fā)和個體化醫(yī)療提供基礎。這種分析常常需要對多樣本多位點進行高通量并行分析，但國家缺少具有自主知識產(chǎn)權的技術平臺，因此研發(fā)快速、準確、高通量且高靈活性的SNPs分析檢測系統(tǒng)非常重要。
　　 基于上述重大

2、需求，在本論文中，我們將磁分離技術、磁性顆粒微陣列技術、單堿基延伸技術與自動磁分離工作站系統(tǒng)相結合，建立了一系列高通量、自動化、高特異性以及高實用性的單堿基差異檢測新方法及輔助平臺，并圍繞著這一目的開展深入的應用基礎研究。具體內(nèi)容包括：
　　 1.鏈親和素修飾金磁納米顆粒的制備
　　 首先合成了包被有膠體金的金磁納米顆粒(Gold coated magnetic nanopartieles，GMNPs)，然后，分別通過使

3、用物理吸附與共價結合的方法制備鏈親和素-金磁納米顆粒。利用半胱胺(Cysteamine，CE)和11’巰基十一烷酸(11-Mercaptoundecanoic Acid,MUA)做為手臂分子在金磁復合顆粒表面共價修飾鏈親和素。多種分析結果證明利用MUA和CE共價修飾的鏈親和素-金磁納米顆粒，鏈親和素在其表面固定牢固，熒光背景低，生物相容性好，非常適用于免疫檢測、核酸雜交等研究和實際應用。由于利用MUA作為手臂分子比CE捕獲生物素標記的寡

4、核苷酸序列更多一些，因此，利用MUA制各的鏈親和素.金磁顆粒被優(yōu)選用于構建磁性顆粒微陣列。
　　 2.磁性顆粒微陣列與雙色熒光雜交的核酸檢測方法
　　 在上述成功制備鏈親和素修飾金磁納米顆粒后，我們進一步提出了一種將金磁納米顆粒與生物芯片相結合的磁性顆粒微陣列技術，并應用于核酸多態(tài)性分析。將DNA-金磁顆粒復合物點樣到底部固定有磁鐵的載玻片上構建磁性顆粒微陣列，通過雙色熒光雜交進行核酸多態(tài)性分析。應用該方法成功地對來自2

5、4個樣本的3個多態(tài)位點進行了分型，并將結果進行了驗證。同時改進靶序列的擴增方法，即利用不對稱PCR直接擴增出單鏈DNA，將捕獲有單鏈DNA的金磁納米顆粒復合物點樣到固定有磁鐵的載玻片上構建磁性顆粒微陣列，通過與雙色熒光探針雜交實現(xiàn)了對樣本的分型。由于避免了熱變性的步驟，使得該方法能夠適用于大多數(shù)商業(yè)化鏈親和素-金磁顆粒與自動化工作站平臺，將大大擴展該方法的應用范圍。利用金磁納米顆粒作為載體完成分型操作，該方法具有操作簡單、快速等特點，同

6、時還易于實現(xiàn)高并行、自動化樣品的制備。通過磁性顆粒微陣列，我們還在同一個雜交框內(nèi)實現(xiàn)了多樣本的雜交反應，大大降低了雜交反應中對試劑與熒光檢測探針的用量。
　　 3.基于磁分離和延伸技術的單堿基差異檢測
　　 在上述研究基礎上，我們進一步發(fā)展了將金磁納米顆粒與單堿基延伸技術相結合的高通量單堿基差異檢測方法。首先，將生物素標記的特異性延伸引物(Biotinylated extensionprimer,BioEP)固定在修飾有

7、鏈親和素的金磁納米顆粒上，形成固相延伸引物。將包含有固相延伸引物、酶、靶序列以及熒光標記的特定ddNTP單體的延伸反應體系加入反應微孔板內(nèi)進行單堿基循環(huán)延伸。反應后，純合型樣本只延伸上去一種熒光標記ddNTP，而雜合型樣本延伸上兩種不同的熒光標記ddNTP。最后將延伸有熒光單體的金磁納米顆粒點樣到載玻片表面構建“磁性顆粒微陣列”，通過檢測顆粒表面熒光信號強度值確定樣本的基因型。利用單色熒光標記的ddNTP進行延伸，我們對96個樣本的4個

8、位點進行了檢測：接著我們又類似地利用雙色熒光標記的ddNTP進行延伸并成功地對320個樣本進行了檢測。單堿基循環(huán)延伸方法的最大優(yōu)點是避免了任何基于雜交技術SNP分型方法中，由于錯配探針雜交產(chǎn)生的假陽性信號，因此具有極高的準確性，信噪比大于25。此外，我們將全基因組擴增與基于磁分離的單堿基延伸技術相結合，成功實現(xiàn)了對多樣本多位點的同時檢測。本文以磁性顆粒微陣列和單堿基延伸為基礎，成功實現(xiàn)了多樣本的在片延伸SNP檢測，拓展了磁性顆粒微陣列的

9、應用范圍。
　　 4.自動磁分離工作站
　　 雖然本論文所研發(fā)的檢測方法能夠適用于各種商業(yè)化自動化檢測平臺，但鑒于目前自動化工作站的昂貴價格難以在各個實驗室推廣，為此，我們研發(fā)了同時具備磁分離功能和溫控功能的簡易自動磁分離工作站。該系統(tǒng)使用條形銣鐵硼強磁體組成一定形狀的磁鐵陣列，通過步進電機控制螺旋絲桿來移動磁鐵陣列以及市售96孔板的位置，使兩者相嵌合，這時各個微孔內(nèi)磁性納米復合顆粒連帶著其上特異性結合的生物大分子被吸附