基于高通量測序方法研究家蠶品種間產(chǎn)絲量差異.pdf

1、家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，吐絲結(jié)繭是其主要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。家蠶從絲腺開始發(fā)育到取食桑葉轉(zhuǎn)化為絲蛋白，再到絲蛋白泌出體外的整個(gè)過程都離不開基因網(wǎng)絡(luò)的相互調(diào)控，了解調(diào)控導(dǎo)致的基因表達(dá)差異可以從根本上了解品種間產(chǎn)絲量差異，從而為提高家蠶產(chǎn)絲量提供可能。以高絲量品種872和低絲量品種大造5v3d絲腺為材料，通過FAIRE-seq測序數(shù)據(jù)分析，鑒定差異調(diào)控位點(diǎn)；利用RNA-seq鑒定差異表達(dá)基因，找出可能影響產(chǎn)絲量基因；最后，聯(lián)合差異“峰”（“峰”等

2、同于開放染色質(zhì)區(qū)域OCR、亦等同于核小體刪除區(qū)域）和差異基因，鑒定可能影響絲量差異的調(diào)控元件。
　　1．FAIRE-seq鑒定潛在調(diào)控位點(diǎn)
　　經(jīng)過872和大造5v3d絲腺FAIRE－seq數(shù)據(jù)分析：首先，進(jìn)行“峰”鑒定，872和大造分別鑒定到103,779和102,457個(gè)置信“峰”（開放染色質(zhì)區(qū)域），占基因組比例約10％，可能由于5v3d絲腺開始大量合成絲蛋白，使得開放比例增大。進(jìn)一步鑒定分析發(fā)現(xiàn)，872和大造品種差異“

3、峰”分別為11,947和10,600個(gè)，共有“峰”占比90%。對(duì)TSS上下游“峰”信號(hào)的集成性分析以及“峰”長度分布統(tǒng)計(jì)，“峰”信號(hào)主要富集在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游~125bp，其長度呈現(xiàn)連續(xù)分布趨勢，大部分在500bp以下，最長的開放染色質(zhì)區(qū)域不超過3000bp。推測大量基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游125bp附近。此外，通過對(duì)“峰”進(jìn)行注釋分析，發(fā)現(xiàn)很多已知的調(diào)控位點(diǎn)處于開放狀態(tài)。例如絲蛋白編碼基因fib-H，fib-L，P25和s

4、er1，部分已經(jīng)順勢作用元件已經(jīng)確定，這些元件中絕大部分重合于我們鑒定到開放染色質(zhì)區(qū)域，進(jìn)一步證明了FAIRE-seq鑒定調(diào)控元件的可靠性。
　　通過FAIRE-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們成功獲得了5v3d家蠶開放染色質(zhì)圖譜，這些圖譜包含增強(qiáng)子，啟動(dòng)子及其他重要的調(diào)控元件；同時(shí)對(duì)5v3d家蠶872和大造品種的比較，獲得了品種特異的調(diào)控區(qū)域或元件。
　　2．RNA-seq鑒定絲量相關(guān)差異表達(dá)基因
　　通過Pearson相關(guān)

5、性分析和質(zhì)量控制，在872和大造中，選擇4組符合要求的數(shù)據(jù)，進(jìn)行后續(xù)分析。Top20高表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)基因主要為絲蛋白、核糖體蛋白以及延伸因子等編碼基因；對(duì)不同家蠶品種絲蛋白表達(dá)情況調(diào)查顯示，872中絲蛋白編碼基因的表達(dá)量皆高于大造；差異基因鑒定結(jié)果，共有差異基因1657個(gè)；利用KEGG和GO分析對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋-GO注釋結(jié)果，分子功能分類中，有很多基因參與蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控；KEGG富集分析，差異基因在嘌呤代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

6、中蛋白的加工處理、核糖體、嘧啶代謝等通路富集。
　　通過RNA-seq數(shù)據(jù)分析，我們鑒定到了絲蛋白合成和分泌相關(guān)的差異基因。
　　3．FAIRE-seq和RNA-seq關(guān)聯(lián)分析
　　將差異基因與OCR相關(guān)聯(lián)，131個(gè)差異基因在啟動(dòng)子區(qū)域存在特異的“峰”134個(gè)：其中，40個(gè)基因在872上游啟動(dòng)子區(qū)域有特異“峰”，且基因表達(dá)量872相對(duì)于大造上調(diào)，35個(gè)基因在大造啟動(dòng)子區(qū)域有特異“峰”，且基因表達(dá)量大造相對(duì)于872上調(diào)，

7、我們定義其為候選正調(diào)控區(qū)域（CPRRs）；30個(gè)基因在872上游啟動(dòng)子區(qū)域有“峰”，872相對(duì)于大造基因表達(dá)量下調(diào)，29個(gè)基因大造上游有“峰”，872相對(duì)大造基因表達(dá)量下調(diào)，我們定義為候選負(fù)調(diào)控區(qū)域（CNRRs）。其中，有3個(gè)基因受到了正負(fù)調(diào)控區(qū)域的共同影響。對(duì)這些基因GO富集分析發(fā)現(xiàn)，基因富集在分解代謝和合成代謝分類中，可能對(duì)絲蛋白質(zhì)合成有重要意義。對(duì)候選的正調(diào)控區(qū)域和負(fù)調(diào)控區(qū)域影響下872和大造差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析。

8、r>　?。?）候選負(fù)調(diào)控區(qū)域影響下，872中上調(diào)基因主要富集于糖代謝、脂類代謝等基本的物質(zhì)代謝通路，以及核糖體、蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工處理、蛋白的運(yùn)輸通路，而下調(diào)基因主要在信號(hào)相關(guān)通路。糖代謝、脂類代謝等基本物質(zhì)代謝通路主要為絲蛋白的合成和分泌提供能量；核糖體是蛋白合成的最小場所，參與核糖體組成相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)能有效增加絲蛋白的合成；蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上加工處理及蛋白運(yùn)輸相關(guān)基因的高量表達(dá)，有利于絲蛋白合成。
　　（2）候選正調(diào)控區(qū)域影

9、響下，872上調(diào)基因特異的富集于3條免疫相關(guān)通路，比如溶酶體、NOD－like受體信號(hào)通路和抗原處理與呈遞，可能與872作為強(qiáng)健多絲品系相關(guān)，可能是872在體質(zhì)上優(yōu)于大造的原因。
　　關(guān)聯(lián)分析FAIRE-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，結(jié)合KEGG富集分析結(jié)果，872上調(diào)基因?qū)τ诩倚Q絲產(chǎn)量有重要意義。
　　4．絲量差異相關(guān)調(diào)控區(qū)域列表及motif分析
　　我們一共獲得了40個(gè)候選正調(diào)控區(qū)域和29個(gè)候選負(fù)調(diào)控區(qū)域引起872中

10、基因表達(dá)上調(diào)，motif預(yù)測分析顯示：
　?。?）經(jīng)過JASPAR在線注釋軟件進(jìn)行motif分析，根據(jù)GO注釋查閱其功能，67.5%候選正調(diào)控區(qū)域可以與上調(diào)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合。其中，存在結(jié)合HOX轉(zhuǎn)錄因子的區(qū)域，例如BR轉(zhuǎn)錄因子能夠阻止幼蟲的變態(tài)，在某種程度上延長了絲蛋白合成和分泌的時(shí)間，fkh，該因子相關(guān)報(bào)道顯示，特異的在后部和中部絲腺中表達(dá)，而 Ubx對(duì)絲腺的發(fā)育起著重要作用。
　?。?）候選負(fù)調(diào)控區(qū)域motif預(yù)