白藜蘆醇通過(guò)上調(diào)SIRT1增加自噬流并促進(jìn)氧化低密度脂蛋白在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的降解.pdf

1、目的：
　　氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的自噬障礙參與了動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展。白藜蘆醇(RSV)對(duì)Ox-LDL引起的HUVECs損傷有保護(hù)作用。本研究旨在探討Ox-LDL引起HUVECs自噬障礙的具體機(jī)制，并探討RSV保護(hù)HUVECs的作用是否與其調(diào)控自噬流有關(guān)。
　　方法：
　　以HUVECs為研究動(dòng)脈粥樣硬化的工具細(xì)胞；以O(shè)x-LDL及SIRT1激動(dòng)劑RSV為工具

2、藥；使用不同濃度及時(shí)間點(diǎn)的Ox-LDL及RSV處理HUVECs,采用CCK8檢測(cè)Ox-LDL及RSV對(duì)HUVECs活力的影響；采用western blot檢測(cè)HUVECs中SIRT1、LC3-II/LC3-I、p62的蛋白表達(dá)水平；采用反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)檢測(cè) Ox-LDL對(duì)HUVECs內(nèi) p62的轉(zhuǎn)錄水平的影響；采用流式細(xì)胞儀及激光共聚焦方法檢測(cè)Dil-Ox-LDL在HUVECs中的聚集變化及RSV對(duì)HUVECs中Dil-O

3、x-LDL聚集的影響；采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建SIRT1基因敲減及GFP-RFP-LC3基因過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型；采用激光共聚焦方法檢測(cè)細(xì)胞中自噬流的改變；采用western blot方法檢測(cè)溶酶體膜蛋白LAMP1及溶酶體酶 cathepsin D蛋白表達(dá)水平；采用 cathepsin D活性試劑盒檢測(cè)cathepsin D活性。
　　結(jié)果：
　　1.Ox-LDL能劑量（0、30、60、90、120μg/ml）、時(shí)間（0、0.5、1、

4、3、6、12、24 h）依賴(lài)性增加HUVECs中LC3II、p62蛋白的表達(dá)，減少SIRT1蛋白表達(dá)；CCK8結(jié)果示Ox-LDL能劑量依賴(lài)性降低HUVECs活性（90μg/ml、120μg/ml有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；RT-PCR結(jié)果示Ox-LDL對(duì)HUVECs的p62轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯影響；在使用巴弗洛霉素（BAF-1）完全阻斷自噬流情況下，Ox-LDL不能增加LC3II的蛋白水平。
　　2.0-50μM的RSV對(duì)HUVECs活性無(wú)損傷。R

5、SV能劑量（0、12.5、25、50μM）及時(shí)間（0、0.5、1、3、6、12 h）依賴(lài)性增加HUVECs中SIRT1、LC3II并減少p62的蛋白水平。
　　3.50μM RSV能增加被Ox-LDL減少的SIRT1蛋白水平、減少被Ox-LDL增加的p62蛋白水平，并能進(jìn)一步增加LC3II的蛋白水平；激光共聚焦及流式細(xì)胞儀結(jié)果示RSV能顯著減少HUVECs內(nèi)Dil-Ox-LDL的聚集；但RSV并未減少HUVECs膜上被Ox-LDL

6、誘導(dǎo)增加的植物凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）蛋白表達(dá)。
　　4.激光共聚焦結(jié)果示 Ox-LDL能增加轉(zhuǎn)染過(guò) GFP-RFP-LC3的 HUVECs中的GFP-LC3、RFP-LC3的共定位，RSV能顯著減少 HUVECs中被 Ox-LDL引起的GFP-RFP-LC3共定位并進(jìn)一步增加RFP-LC3的點(diǎn)狀分布；Ox-LDL未改變HUVECs中溶酶體膜蛋白LAMP1的蛋白表達(dá)；RSV能增加被Ox-LDL減少的HUVE

7、Cs中溶酶體酶cathepsin D的成熟片段的蛋白表達(dá)；cathepsin D活性試劑盒結(jié)果進(jìn)一步提示RSV能增加被Ox-LDL降低的HUVECs中cathepinsin D的活性；在使用巴弗洛霉素A1（抑制自噬體和溶酶體融合）后，RSV不能減少HUVECs中Dil-Ox-LDL的聚集。
　　5.在敲減HUVECs中的SIRT1基因后，RSV對(duì)Ox-LDL引起的HUVECs中的SIRT1、LC3II、p62、cathepisin

8、 D蛋白水平改變的保護(hù)作用消失、同時(shí)不能增加被Ox-LDL降低的cathepsin D的酶活性，并且不能減少HUVECs中Dil-Ox-LDL的聚集。
　　結(jié)論：
　　白藜蘆醇通過(guò)上調(diào)HUVECs中SIRT1的表達(dá)，可以增加溶酶體中cathepsin D的蛋白水平及 cathepsin D酶活性而修復(fù)被 Ox-LDL損傷的溶酶體功能，從而提高HUVECs中被Ox-LDL損傷的自噬流，進(jìn)一步促進(jìn)Ox-LDL在HUVECs中通過(guò)