骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NMⅡ基因調(diào)控對吸入性損傷療效及機(jī)制研究.pdf

1、吸入性損傷在人類城市發(fā)展史中曾造成巨大的災(zāi)難，1942年美國波士頓椰樹林夜總會火災(zāi)，密閉空間起火后患者吸入大量未燃燼的煙霧、炭粒、有刺激性的化學(xué)物質(zhì)等，雖經(jīng)搶救，但是大量死亡，共造成造成492人死亡，成為美國傷亡最為慘重的火災(zāi)事故，主要就是吸入性損傷所致。上海2010年11月15日，靜安區(qū)膠州路重大火災(zāi)，上海市醫(yī)療機(jī)構(gòu)共救治傷員127人，其中死亡41人，收治住院治療71人，死亡和住院的大部分人都有吸入性損傷，其發(fā)病率和病死率非常高。

2、r>　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)是一類具備自我更新和分化潛能的多能干細(xì)胞，取材簡便，不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，具有重要的免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性，研究發(fā)現(xiàn)其能夠向多種組織誘導(dǎo)分化，如骨、軟骨等，同時(shí)具備較強(qiáng)的內(nèi)分泌能力和免疫調(diào)節(jié)功能，是理想的組織修復(fù)來源，近年研究證實(shí)，BMSC移植能改善急性肺損傷(ALI)肺內(nèi)及全身的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)AL2體內(nèi)免疫紊亂，“歸巢”至肺損傷區(qū)域，向肺內(nèi)功能細(xì)胞分化并發(fā)揮相應(yīng)功能，參與受損肺組織的修復(fù)，因而被認(rèn)為是急

3、性肺損傷治療中極具前景的治療措施。
　　雖然BMSC移植治療AL2有很好的效果，但是在體內(nèi)的移植率和存活率受多因素影響，壞死或凋亡是最主要形式，因此，提高或者改善BMSC移植后在體內(nèi)的移植率和存活率是這種治療方法得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在，越來越多的研究者提出了多種學(xué)說，探索了多種方法以期能夠提高移植BMSC的移植率和存活率。
　　肌球蛋白是一種球蛋白，是肌肉的主要組成分子，主要為肌肉收縮提供力，它具有酶的活性，可以通過與肌動(dòng)蛋

4、白相互作用，水解ATP的末端磷酸基團(tuán)和GTP、CTP等，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能。肌球蛋白也廣泛存在于非肌肉組織中稱為非肌肉球蛋白，非肌肉肌球蛋白Ⅱ(non-muscle myosinⅡ，NMⅡ)是非肌球蛋白家族中的一種，文獻(xiàn)報(bào)道它是多種疾病的關(guān)鍵分子，參與了細(xì)胞的各種生理活動(dòng)，特別是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，它是細(xì)胞正常生理活動(dòng)的一種關(guān)鍵蛋白分子，具有很重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用，因此具有很高的研究價(jià)值。
　　鑒于此，我們選取NMⅡ?yàn)檠芯繉ο?，并?jīng)

5、過前期研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中非肌肉球蛋白NMⅡ，再移植到煙霧急性肺損傷的模型上，通過比較發(fā)現(xiàn)其效果比單純無修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植效果更好。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控NMⅡ基因可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在移植凋亡、減輕炎癥反應(yīng)等方面比未調(diào)控NMⅡ基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更為明顯。通過一系列實(shí)驗(yàn)后我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)NMⅡ基因表達(dá)能夠抑制干細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至損傷部位，降低損傷部位炎癥反應(yīng)，比傳統(tǒng)的單純使用間充質(zhì)干細(xì)胞更為有

6、效，尤其對毛細(xì)血管豐富的肺部損傷更加有效。
　　對NMⅡ基因進(jìn)一步深入研究，可以為干細(xì)胞治療煙霧吸入性損傷以及ALI/ARDS引入新的研究靶點(diǎn)并向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。
　　第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備及鑒定
　　目的:根據(jù)課題研究的目的，制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，為后續(xù)研究NMⅡ基因調(diào)控治療吸入性損傷模型的療效和保護(hù)機(jī)制提供載體。
　　方法:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)過程如下:選取周齡4周，體重160g

7、-200g左右的雄性大鼠，分離大鼠的股骨和脛骨獲取骨髓，200目濾網(wǎng)過濾至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃溫度下5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)2-3代后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、表面抗原鑒定、分化潛能的鑒定。
　　結(jié)果:顯微鏡下觀察到貼壁細(xì)胞的形態(tài)大小不一，形態(tài)各樣，大部分成梭形生長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型鑒定為符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原;細(xì)胞經(jīng)過成脂成骨誘導(dǎo)后為陽性。
　　結(jié)論:經(jīng)過鑒定，所獲取的細(xì)胞為骨髓間

8、充質(zhì)干細(xì)胞。
　　第二部分 干擾NMⅡ表達(dá)的載體構(gòu)建和細(xì)胞株的篩選
　　目的:制備NMⅡ表達(dá)降低的細(xì)胞株，為后續(xù)治療提供細(xì)胞。
　　方法:通過干擾序列的設(shè)計(jì)和重組載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染前面已鑒定的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，然后進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:得到重組后的PLL載體，轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，得到了NMⅡ表達(dá)降低的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　結(jié)論:經(jīng)過鑒定，轉(zhuǎn)染重組載體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NMⅡ表達(dá)降低。
　　第三部

9、分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NMⅡ基因調(diào)控對吸入性損傷療效及機(jī)制研究
　　目的:檢測NMⅡ基因調(diào)控的骨髓間充干細(xì)胞對吸入性損傷模型的治療效果并探討其機(jī)制
　　方法:首先建立煙霧吸入性肺損傷模型;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組為對照組，損傷組，BMSC治療組，BMSC-ShRNA治療組四組;分別采集大鼠動(dòng)脈血進(jìn)行血?dú)夥治?使用探針CM-DiI標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞在大鼠體內(nèi)的分布情況;大鼠支氣管肺泡灌洗液的收集;大鼠肺臟的干濕比測定;H

10、E檢測24h肺部的炎癥反應(yīng)情況;ELISA檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-10因子;NMⅡ基因沉默對BMSC細(xì)胞凋亡的影響;NMⅡ基因沉默對BMSC細(xì)胞旁分泌系統(tǒng)的影響。
　　結(jié)果:干細(xì)胞移植后的24h時(shí)間點(diǎn)取血進(jìn)行血?dú)夥治霭l(fā)現(xiàn)，損傷組大鼠出現(xiàn)明顯的低氧血癥、二氧化碳潴留和酸中毒癥狀;而治療組與損傷組比較差異具有顯著性，可推斷BMSCs移植后對肺損傷有治療作用。使用CD-DiI標(biāo)記的轉(zhuǎn)染NMⅡ-ShRNA的骨髓

11、間充質(zhì)干細(xì)胞，尾靜脈注射吸入性損傷模型，1、4、7天取大鼠肺臟，染色，熒光顯微鏡下觀察到BMSCs細(xì)胞的歸巢。HE染色發(fā)現(xiàn)干擾組的損傷情況明顯減輕。肺泡灌洗液(BALF) ElISA法檢測肺泡灌洗液中TNF-a降低和IL-10的濃度升高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的干擾組比為干擾組的caspase-3表達(dá)明顯降低。NMⅡ基因沉默對BMSC細(xì)胞旁分泌系統(tǒng)HGF的VEGF都比正常組升高。
　　結(jié)論:下調(diào)NMⅡ基因表達(dá)能夠抑制干細(xì)胞凋亡，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)