細(xì)菌生物膜對天然及工程納米顆粒的響應(yīng)機(jī)制.pdf

1、土壤中超過90％的微生物以生物膜的形式存在。生物膜可通過形成的胞外聚合物使其獲得競爭性優(yōu)勢，如加強(qiáng)生物膜內(nèi)微生物之間群體感應(yīng)效應(yīng)、幫助細(xì)胞在表面定殖、減少污染物的細(xì)胞毒性等。工業(yè)生產(chǎn)釋放進(jìn)入土壤以及土壤中天然存在的納米顆粒(NPs)由于表面活性強(qiáng)，在土壤生物膜的形成、結(jié)構(gòu)調(diào)控和功能發(fā)揮等方面具有重要作用。然而，目前對土壤中生物膜和NPs間相互作用及其功能的了解還相當(dāng)欠缺，特別是從分子水平上對這些作用過程和機(jī)理的認(rèn)識非常膚淺。因此，本課題

2、選取外源工程N(yùn)Ps氧化鋅(ZnO)和土壤納米礦物赤鐵礦(hematite)與代表性土壤細(xì)菌-惡臭假單胞菌，運(yùn)用化學(xué)方法、微生物及分子生物學(xué)技術(shù)和借助現(xiàn)代儀器分析手段如激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、石英晶體微天平(QCM-D)、等溫滴定微量熱儀(ITC)、結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微鏡(SIM)等，分析不同類型NPs與細(xì)菌相互作用的分子機(jī)理，探討NPs對細(xì)菌生物膜形成、結(jié)構(gòu)和功能的影響，明確生物

3、膜中細(xì)胞對NPs響應(yīng)的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)闡明了表面結(jié)合態(tài)腐殖酸(HA)介導(dǎo)下的赤鐵礦納米顆粒對惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的細(xì)胞毒性機(jī)制。純赤鐵礦納米顆粒能夠顯著抑制細(xì)菌的生長，其半致死濃度(24h-LC50)為23.58mg L-1，而表面結(jié)合HA后可以顯著減輕赤鐵礦的毒性，其復(fù)合體的最大LC50達(dá)到4774.23mg L-1，這一結(jié)果也在納米顆粒對惡臭假單胞菌細(xì)胞活性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄

4、調(diào)控影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中被證實(shí)。共沉淀實(shí)驗(yàn)和透射電子顯微鏡觀察表明，表面結(jié)合態(tài)的HA阻礙了赤鐵礦納米顆粒對細(xì)菌細(xì)胞的粘附且限制了其發(fā)生內(nèi)生化作用。與純赤鐵礦納米顆粒相比，赤鐵礦-腐殖酸復(fù)合體體系中胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激基因的表達(dá)受到顯著抑制。減少粘附作用和抑制ROS的產(chǎn)生可能是HA減輕赤鐵礦納米顆粒毒性的主要原因。本研究還根據(jù)Derj aguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO)理論模型評估了赤鐵礦和細(xì)

5、菌細(xì)胞膜之間的界面相互作用能，發(fā)現(xiàn)納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞接觸的機(jī)率越大則其細(xì)胞毒性越強(qiáng)，而納米顆粒與細(xì)菌細(xì)胞膜間能壘越大則其對細(xì)菌的毒性越低。研究結(jié)果為更好地理解自然環(huán)境中細(xì)菌或細(xì)菌生物膜與礦物相互作用提供了有益的借鑒。
　　(2)揭示了細(xì)菌生物膜在形成過程中對工程納米顆粒-ZnO NPs的響應(yīng)機(jī)制及納米顆粒的濃度效應(yīng)。在低濃度閾值（0.5-30mg L-1）內(nèi)的ZnO NPs能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長和生物膜的形成，而高濃度的ZnO N

6、Ps(＞30mg L-1)顯著抑制生物膜形成。CLSM分析結(jié)果表明，細(xì)菌細(xì)胞能夠在0.5mg L-1的ZnO NPs表面大量定殖并形成生物膜，而在250mg L-1的ZnO NPs表面的細(xì)胞定殖和形成的生物膜生物量比純細(xì)菌對照體系中生物膜生物量低11倍。0.5mg L-1的ZnO NPs體系中所測得的生物膜基質(zhì)中蛋白質(zhì)和糖含量的顯著增加進(jìn)一步證實(shí)了ZnO NPs的低濃度刺激效應(yīng)。各處理中細(xì)胞生長和生物膜形成的顯著差異也在細(xì)胞氧化應(yīng)激以及

7、生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。0.5mg L-1的ZnO NPs能夠刺激惡臭假單胞菌群體感應(yīng)基因、脂多糖生物合成基因和抗生素抗性基因的表達(dá);而500mg L-1的ZnO NPs高濃度暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生了基因毒性并使得惡臭假單胞菌的抗氧化基因表達(dá)顯著上調(diào)。
　　(3)考察了納米顆粒(ZnO NPs)對細(xì)菌生物膜形貌和結(jié)構(gòu)的影響。QCM-D結(jié)果顯示，ZnO NPs暴露使得細(xì)菌生物膜厚度和粘彈性降低，粗糙度增加;且ZnO NPs能