激活蛋白激酶A信號減輕阿霉素腎病小鼠白蛋白尿并促進(jìn)腎小球壁層上皮細(xì)胞向足細(xì)胞分化.pdf

1、背景：腎小球血管上皮細(xì)胞（足細(xì)胞）與腎小球基底膜（GBM）、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞一起構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障。各種因素導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷和丟失都可能導(dǎo)致大量蛋白尿,也與腎臟病進(jìn)展相關(guān)。成熟的足細(xì)胞是一種終末分化的上皮細(xì)胞，缺乏分裂增殖能力，不能通過自我增殖來補(bǔ)充丟失的足細(xì)胞。因此減少足細(xì)胞的損傷和增加足細(xì)胞的數(shù)量可能是減輕蛋白尿，延緩腎病進(jìn)展的一種重要途徑。近期研究發(fā)現(xiàn)壁層上皮細(xì)胞（the parietal epithelial cells，PEC

2、s）能在生理及病理情況下表達(dá)足細(xì)胞蛋白。PECs和足細(xì)胞擁有一個(gè)共同的細(xì)胞起源，同時(shí)在解剖位置上兩者相互毗鄰，這使得PECs具有再生足細(xì)胞的潛能。前期研究發(fā)現(xiàn)，腺苷酸環(huán)化酶（cAMP）激動劑Forskolin可通過激活腎小球內(nèi)cAMP信號部分緩解阿霉素腎病誘小鼠白蛋白尿和足細(xì)胞丟失。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A(PKA)激動劑pCPT-cAMP可直接激活PKA信號可防止ADR誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和數(shù)量減少。但是我們不清楚激活cAMP/PKA信號，

3、能否防止阿霉素腎病小鼠中足細(xì)胞的損傷和丟失，并促進(jìn)PECs向足細(xì)胞分化。
　　目的：探討PKA激動劑pCPT-cAMP對阿霉素腎病小鼠的保護(hù)作用，以及pCPT-cAMP是否促進(jìn)壁層上皮細(xì)胞分化。
　　方法：使用6-8周齡Balb/C雄性小鼠，予以ADR（11mg/kg）尾靜脈注射構(gòu)建阿霉素腎病小鼠模型（ADR組），部分小鼠使用pCPT-cAMP腹腔注射治療（A+P組）。使用蛋白電泳+考馬斯染色方法觀察小鼠尿白蛋白變化；糖原染

4、色(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)和六胺銀染色觀察腎臟組織病理學(xué)改變。WT-1免疫組化染色觀察足細(xì)胞數(shù)量，synaptopdodin和desmin免疫熒光雙染觀察足細(xì)胞的損傷。PCNA和claudin1免疫熒光雙染檢測PECs增殖，CD44和nestin免疫熒光雙染觀察PECs活化，p57和claudin1免疫熒光雙染檢測PECs向足細(xì)胞分化。
　　結(jié)果：對照組小鼠尿中無中大分子蛋白，ADR腎病小鼠

5、第二周及第八周時(shí)小鼠尿電泳中中大分子蛋白增多，尿白蛋白/肌酐比值顯著升高，pCPT-cAMP治療則降低ADR腎病小鼠的尿白蛋白/肌酐比值，ADR組和A+P組尿白蛋白/肌酐比值第二周分別是8.07±3.95（mg/mg）和6.06±5.8（mg/mg），P<0.05。第八周時(shí)兩組尿白蛋白/肌酐比值分別是21.83±12.7（mg/mg）和6.37±3.78（mg/mg），P<0.05。PAS染色發(fā)現(xiàn)ADR小鼠腎小球硬化在第八周明顯增多，對

6、照組、ADR組和A+P組的硬化指數(shù)分別是0.13±0.34，1.64±1.65和0.85±1.30，P<0.0001。WT-1免疫組化染色發(fā)現(xiàn)ADR組小鼠腎小球足細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著降低，第二周和第八周足細(xì)胞數(shù)分別為4.72±1.67 vs.7.89±1.77和1.64±1.86 vs.8.26±2.79，P<0.001。pCPT-cAMP可防止ADR腎病小鼠的足細(xì)胞數(shù)量減少，第2周和第8周分別為6.97±1.79和5.35±1.62（

7、和 ADR組比較，P均<0.001）。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，pCPT-cAMP可顯著防止ADR誘導(dǎo)足細(xì)胞特異性蛋白synaptopodin和podocalyxin表達(dá)下降，降低足細(xì)胞損傷標(biāo)志desmin的表達(dá)。相比于ADR組小鼠，pCPT-cAMP降低PCNA+PECs數(shù)量（2.75±3.23 vs1.02±2.16，ADR組 vs. A+P組，P<0.0001）。ADR腎病小鼠PECs重新表達(dá) CD44，pCPT-cAMP顯著抑制PECs

8、CD44表達(dá)。p57/claudin1免疫熒光染色顯示，ADR小鼠腎小球中p57+claudin1+PECs較對照組明顯增多0.276±0.60 vs.0.097±0.30，P<0.05。pCPT-cAMP則使腎小球中p57+claudin1+PECs數(shù)量進(jìn)一步增多0.422±0.66 vs.0.276±0.60（A+P vs. ADR,P<0.05）。
　　結(jié)論：pCPT-cAMP激活PKA信號后可以減輕ADR腎病小鼠的足細(xì)胞損