Ezrin-ACAP4蛋白復合物在胞吐動力學調控中的功能研究.pdf

1、細胞可塑性與動力學特征是維系組織及器官功能特異性及個體健康的基礎，在分子水平上細胞可塑性與動力學特征則體現(xiàn)為蛋白質作用網(wǎng)絡的時空調節(jié)。細胞極化是行使其功能區(qū)域化的基礎，亦是細胞可塑性與動力學特征的綜合表征之一。胃壁上皮細胞是一個典型的極化細胞，負責胃酸與內因子的分泌。為此，胃壁細胞酸分泌不僅為研究胞吐分子機制提供了一個極好的模式體系，同時對其機制的研究亦為闡明胃壁細胞分子生理學及校正胃酸分泌異常奠定基礎。 幽門螺旋桿菌長久地駐留

2、于人類腸胃之中，是人類多種胃病的罪魁禍首，與萎縮性胃炎、胃癌等休戚相關。雖然很久之前人們已經(jīng)知道幽門螺旋桿菌感染能夠導致胃酸分泌的減少，但其分子機制至今仍然懸而未決。以往的研究多集中在免疫調節(jié)細胞，我們的研究結果表明，VacA毒素能夠直接誘導胃壁細胞頂膜通透性的增加，導致胃酸分泌的減少。為此，我們建立了原代培養(yǎng)的胃腺、胃壁細胞等研究模型和良好的評估壁細胞分泌能力的技術平臺，包括氨基比林吸收實驗、激光共聚焦掃描技術等，對VacA感染所導致

3、的壁細胞生理特征的改變進行了深入細致的研究。結果表明：VacA誘導的細胞膜通透性的增加導致了胞外鈣離子的內流，進而引起胞內鈣依賴性蛋白水解酶Calpain Ⅰ蛋白酶的活化，將Ezrin在469與470之間進行切開，從而使得Ezrin分子從壁細胞膜上脫離下來。Ezrin是一個膜蛋白與皮層骨架之間的連接器，它還參與了信號轉導途徑。在壁細胞中，它定位于頂膜，并受到PKA磷酸化修飾的調控，進而影響到HCl的分泌。VacA處理的細胞通過阻止H,K

4、-ATPase管狀囊泡到頂膜上的招募抑制了胃酸的分泌。電鏡結果也顯示，VacA處理導致了Ezrin在壁細胞中完整性的缺失，破壞了壁細胞頂膜微絨毛中肌動蛋白纖維的放射狀排布。值得關注的是：在外源性表達Ezrin水解位點突變體的壁細胞中，雖然進行了VacA感染的處理，但其依然能夠保持泌酸功能的正常進行。我們對VacA感染的細胞中Ezrin的水解現(xiàn)象進行研究，為全面地認識幽門螺旋桿菌誘導胃酸分泌減少的現(xiàn)象提供了一個全新的方位。我們的結果表明，

5、VacA能夠破壞胃壁細胞頂膜與骨架之間的精細連接，進而引發(fā)胃酸分泌的減少。 在研究細胞膜與微絲骨架動力學調控機制過程中我們鑒定出一個新的蛋白復合體，其中包括Ezrin-ACAP4-Arf6。然而，ACAP4與Ezrin之間是否存在著直接的相互作用，它們之間又是如何協(xié)調控制著膜-骨架之間的重構還不是很清楚。利用壁細胞酸分泌為模式體系，我們發(fā)現(xiàn)：Ezrin能夠依賴PKA介導的磷酸化修飾與ACAP4相互作用。我們的體外生化研究結果表明

6、，ACAP4依賴其氨基端400個氨基酸區(qū)域與模擬磷酸化狀態(tài)的Ezrin相互作用，這說明它們之間的相互作用依賴于蛋白自身的構象變化。更為重要的是，在分泌性的壁細胞中，Ezrin特異性地將ACAP4靶向到頂膜，不論是敲除掉Ezrin，還是表達缺失Ezrin結合區(qū)域的ACAP4的片斷，都削弱了ACAP4在頂膜的定位。ACAP4是一個Arf6特異性的GTP酶激活蛋白，它能夠特異性地識別并結合Arf6-GTP。過量表達GAP活性缺陷型的ACAP4

7、突變體抑制了頂膜-骨架的重構和壁細胞酸的分泌。總之，我們的結果為Arf6-ACAP4-Ezrin之間的相互作用和極化上皮細胞的分泌之間提供了一個全新的分子機制的詮釋。綜上所述，本研究闡述了Aff6-ACAP4-ezrin蛋白質作用網(wǎng)絡在壁細胞酸分泌過程中的重要作用及調控分子機制，同時我們研究揭示了幽門螺旋桿菌直接作用于壁細胞并干擾胃酸分泌的病理學分子機制。因此，本研究為系統(tǒng)闡明胃壁細胞分子生理學及防治壁細胞生理學異常所致的消化道疾病提供