接觸腦脊液神經(jīng)元參與疼痛機制的研究.pdf

1、目的：
　　 接觸腦脊液神經(jīng)元(cerebrospinal fluild-contacting neurons，CSF-CNs)，簡稱觸液神經(jīng)元，是位于腦實質(zhì)內(nèi)的一種特殊類型的神經(jīng)元。其特殊之處在于它的胞體位于腦實質(zhì)，而突起卻伸入腦脊液中。我們以往的研究證實，該類神經(jīng)元在腦實質(zhì)的大多數(shù)部位只有零星散在分布，而在中腦與腦橋交界處毗鄰中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)和中縫背核(DR)的腦組織中，卻恒定存在著一個觸液神經(jīng)元高度集中、境界分

2、明的神經(jīng)核團，我們首次在國際上將其命名為接觸腦脊液神經(jīng)核(CSF-contacting nucleus，CSF-CN)，簡稱觸液核?；谒奶厥獾奈恢藐P(guān)系，一方面能通過腦-脊髓-外、周神經(jīng)的途徑參與機體的功能調(diào)控，另一方面也可以通過腦-腦脊液途徑在機體功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用。因此有可能在機體神經(jīng)、體液兩大功能調(diào)節(jié)中扮演著不可或缺的重要角色，但其確切的生物學(xué)功能并不完全清楚。
　　 自發(fā)現(xiàn)這一核團以來的過去20年中，我們圍繞觸液核

3、與疼痛傳導(dǎo)、調(diào)制關(guān)系已經(jīng)進行了一系列整體研究，先后證實在不同疼痛條件下，觸液核的c-Fos、GABA、5-HT及其受體、TRPM8和ERK等10余種神經(jīng)活性物質(zhì)（遞質(zhì)、受體、離子通道等）可以發(fā)生表達的變化，且與疼痛的行為和強度具有時相的相關(guān)性。然而整體研究因受到機體調(diào)控作用的影響而難以凸顯觸液核本身的生物學(xué)特點。對于觸液核參與生命活動的細胞與分子機制研究，如能排除整體調(diào)節(jié)因素的影響，相對獨立地觀察觸液神經(jīng)元中相關(guān)物質(zhì)的表達與調(diào)控則更為科

4、學(xué)可靠。因此本研究創(chuàng)新性地將觸液核進行原代培養(yǎng)，在相對統(tǒng)一、便于操控的離體實驗條件下研究其在疼痛中的具體作用機制。
　　 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、酸敏感離子通道蛋白3(acid-sensing ionchannel3，ASIC3)和P物質(zhì)(substance P，SP)均與疼痛關(guān)系密切。ASIC3是對pH值改變最敏感的酸受體，與炎性痛、神經(jīng)病理性痛等多種痛覺有關(guān)。PKC是 ASIC3在疼痛中發(fā)揮作

5、用的重要上游調(diào)節(jié)途徑。SP是疼痛信號傳遞的經(jīng)典遞質(zhì)，是ASIC3參與疼痛傳遞的下游信號分子。那么在觸液神經(jīng)元中是否存在PKC-ASIC3-SP信號通路？此信號通路在觸液神經(jīng)元參與的疼痛中發(fā)揮著怎樣的作用？具體機制為何？尚未見報道。
　　 綜上所述，本研究將在體研究與離體研究相結(jié)合，從整體、細胞、分子水平闡明觸液神經(jīng)元中PKC-ASIC3-SP信號通路的激活與調(diào)控在疼痛中的作用。本研究成果將揭示觸液神經(jīng)元參與疼痛的細胞與分子機制，

6、豐富研究觸液神經(jīng)元的方法學(xué)，為臨床疼痛性疾病的治療提供新的思路。
　　 材料與方法
　　 一、觸液神經(jīng)元的離體培養(yǎng)與鑒定
　　 （一）實驗動物1、雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠SPF級(250-280g)，所有實驗均得到徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會的許可。
　　 2、雌性SD大鼠SPF級，孕18天，所有實驗均得到徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會的許可。
　　 （二）實驗分組A組（側(cè)腦室注

7、射CB-HRP），B組（側(cè)腦室注射CB），C組(側(cè)腦室注射CB-FITC)，D組（腦實質(zhì)觸液核旁注射CB-FITC）:(n=6)。
　　 （三）側(cè)腦室注射標(biāo)記觸液核大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后固定至動物立體定位儀。立體定位（Bregma:-1.2±0.4 mm,Depth:3.2±0.4 mm,Right to median sagittal plane:1.4±0.2mm），側(cè)腦室注射上述各分組藥物各3μl，

8、動物靜養(yǎng)48h后灌注、固定、取材，免疫熒光技術(shù)標(biāo)記觸液核，CB-FITC組無需免疫反應(yīng)過程。
　　 （四）核團注射標(biāo)記觸液核大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉后固定至動物立體定位儀。立體定位(Bregma:-8.2±0.2 mm, Depth:7.0±0.4 mm, Right to median sagittal plane:0.2±0.1 mm)，腦實質(zhì)觸液核注射CB-FITC1μl，動物靜養(yǎng)48h后灌注、固定、取

9、材，組織按正常程序處理后無需免疫反應(yīng)過程直接在共聚焦顯微鏡下觀察觸液核熒光標(biāo)記情況。
　　 （五）組織免疫熒光染色深麻醉、灌注取材后固定，蔗糖脫水，冰凍切片、免疫熒光雙標(biāo)、激光共聚焦顯微鏡下觀察CB-HRP和CB對觸液核的標(biāo)記情況。CB-FITC標(biāo)記組無需傳統(tǒng)的免疫反應(yīng)過程，切片后直接貼片用共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)價觸液核效果。
　　 （六）觸液神經(jīng)元的原代培養(yǎng)將懷孕18天SD大鼠胚胎取出，按照觸液核定位選取組織。剪碎-消化-

10、離心-吹打-過濾，以0.5-1.0×105/cm2的密度接種于預(yù)處理（采用D-多聚賴氨酸）的培養(yǎng)瓶或24孔培養(yǎng)板（內(nèi)置直徑1 cm的蓋玻片），參照一般中樞神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。
　　 （七）DAPI熒光染色將生長于24孔培養(yǎng)板的觸液神經(jīng)元，用DAPI染細胞核，在OlympusVanox熒光顯微鏡上觀察。
　　 （八）CB-FITC標(biāo)記原代培養(yǎng)的觸液神經(jīng)元將CB-FITC于實驗前24h作用于細胞，無需傳統(tǒng)的免疫反應(yīng)過

11、程，可直接用于離體觸液神經(jīng)元鑒定、形態(tài)觀察、遞質(zhì)檢測等。
　　 （九）統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以mean±SEM表示;用GraphPad Prism5.0軟件(GraphPad Software，USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析(one-way ANOVA followed by a post hoc Tukey test)及作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、離體觸液神經(jīng)元疼痛模型的構(gòu)建及痛相關(guān)遞質(zhì)表達檢測（一）實驗動物

12、SPF級，雌性孕18天SD大鼠，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。
　　 （二）實驗分組將接種于24孔培養(yǎng)板的細胞，分為A-E五組，每組又分為正常生長組和疼痛組(n=6)。通過免疫熒光雙標(biāo)檢測各組遞質(zhì)表達情況，用ELISA分別檢測各組細胞在疼痛狀態(tài)下與正常生長狀態(tài)下遞質(zhì)表達量并作出比較。
　　 A組:5-HT表達情況;
　　 B組:GABA表達情況;
　　 C組: ERK表達情況;
　　 D組:c-F

13、os表達情況;
　　 E組:TRPM8表達情況。
　　 （三）觸液神經(jīng)元的原代培養(yǎng)同前。
　　 （四）觸液神經(jīng)元細胞疼痛模型的建立用100μM的dmPGE2刺激離體培養(yǎng)的觸液神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)疼痛發(fā)生。
　　 （五）細胞免疫熒光雙標(biāo)染色實驗前24h在培養(yǎng)基中加入CB-FITC標(biāo)記觸液神經(jīng)元，待測遞質(zhì)免疫反應(yīng)過程為:漂洗細胞-室溫固定-透化處理-封閉-一抗過夜-紅色二抗-終止反應(yīng)-封片，于熒光顯微鏡上觀察。

14、r>　　 （六）酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測遞質(zhì)表達ELISA測定各組遞質(zhì)表達。按試劑盒說明書完成實驗步驟，以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定在加終止液后5分鐘以內(nèi)進行。
　　 （七）統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以mean±SEM表示;用GraphPad Prism5.0軟件(GraphPad Software，USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析（ANOVA）及作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　

15、三、觸液神經(jīng)元PKC-ASIC3-SP信號通路在疼痛中的激活與調(diào)控（一）實驗動物1、雄性SD大鼠SPF級，250-280g，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。
　　 2、雌性SD大鼠SPF級，孕18天，由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。
　　 （二）實驗分組1、在體研究SD雄性大鼠隨機分為A、B、C三組(n=6)。用完全弗氏佐劑(CFA)制作炎性痛模型，對照組用同樣注射方法相等劑量注射PBS，觀察物質(zhì)表達變化與動物疼痛行為的相關(guān)

16、性。
　　 A組:PKC組，再分為對照組、抑制劑組、模型組和模型組+抑制劑組;
　　 B組:ASIC3組，再分為對照組、抑制劑組、模型組和模型組+抑制劑組;
　　 C組:SP組，再分為對照組、抑制劑組、模型組和模型組+抑制劑組。
　　 2、離體研究
　　 原代培養(yǎng)的觸液神經(jīng)元接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，隨機分為A、B、C三組(n=6)，疼痛模型組dmPGE2誘導(dǎo)疼痛后，分別檢測PKC、ASIC3和S

17、P活化峰值時間點，通過抑制劑的給予觀察各物質(zhì)之間的調(diào)控作用。
　　 A組:PKC組，再分為對照組、抑制劑組、模型組和模型組+抑制劑組;
　　 B組:ASIC3組，再分為對照組、抑制劑組、模型組和模型組+抑制劑組;
　　 C組:SP組，再分為對照組、抑制劑組、模型組和模型組+抑制劑組。
　　 （三）觸液神經(jīng)元的原代培養(yǎng)同前。
　　 （四）細胞疼痛模型制作同前。
　　 （五）大鼠炎性痛模型制做

18、大鼠左側(cè)足底皮下注射CFA100μl，建立炎性痛模型。CFA足底注射后產(chǎn)生典型的外周炎癥表現(xiàn)包括:注射部位局部的紅、腫、疼痛等，持續(xù)時間大于一周。
　　 對照組:大鼠左側(cè)足底皮下注射PBS100μl。
　　 （六）組織免疫熒光雙標(biāo)雄性SD大鼠側(cè)腦室注射CB-FITC48h后深麻醉、灌注取材后固定，蔗糖脫水，冰凍切片、加p-PKC、ASIC3和SP一抗孵育，紅色二抗，激光共聚焦顯微鏡下分別觀察CB-FITC（綠色）與p-P

19、KC、ASIC3和SP陽性（紅色）雙標(biāo)情況。
　　 （七）疼痛行為學(xué)觀察分別在模型后15min、30min、45min、60min、75min和90min:采用熱痛敏儀測定熱縮足潛伏期(Thermal Withdrawal Latency，TWL)評估熱痛敏。
　　 （八）物質(zhì)表達定量檢測1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)2、免疫印跡法（九）統(tǒng)計學(xué)處理用GraphPad Prism5.0軟件(GraphPad Softw

20、are，USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析并生成統(tǒng)計圖表。計量資料以mean±SEM表示。多個實驗組之間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Tukey's post hoc test檢驗，熱縮足潛伏期結(jié)果采用雙因素方差分析(two-way ANOVA，時間為組內(nèi)因素，處理為組間因素)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一、觸液神經(jīng)元的離體培養(yǎng)與鑒定（一）CB-HRP、CB和C

21、B-FITC對觸液核標(biāo)記效果比較經(jīng)大鼠側(cè)腦室注射分別給予CB-HRP、CB和CB-FITC，三者均可特異性地、科學(xué)可靠地標(biāo)記觸液核(n=6，P＞0.05)。
　　 （二）側(cè)腦室與腦實質(zhì)分別注射CB-FITC對觸液核標(biāo)記效果比較將CB-FITC分別注入側(cè)腦室和觸液核，兩種不同標(biāo)記途徑對觸液核的標(biāo)記效果無差別(n=6，P＞0.05)。
　　 （三）觸液神經(jīng)元的原代培養(yǎng)與特異性標(biāo)記原代培養(yǎng)的觸液神經(jīng)元生長7-10天左右發(fā)育成熟

22、。用神經(jīng)元細胞核抗體NeuN、DAPI與CB-FITC共同標(biāo)記原代培養(yǎng)成熟的觸液神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)本培養(yǎng)條件下細胞中約有98％為神經(jīng)元(NeuN標(biāo)記陽性)，這其中有92％左右為觸液神經(jīng)元（CB-FITC標(biāo)記陽性）。
　　 二、離體觸液神經(jīng)元疼痛模型的構(gòu)建及痛相關(guān)遞質(zhì)檢測原代培養(yǎng)的觸液神經(jīng)元在正常生長狀態(tài)下和疼痛狀態(tài)下均有5-HT、GABA、ERK、c-Fos和TRPM8表達，且各種遞質(zhì)在疼痛組表達量均明顯高于正常生長組(n=6，P＜0

23、.05)。
　　 三、觸液神經(jīng)元PKC-ASIC3-SP信號通路在疼痛中的激活與調(diào)控1、在體觸液核PKC、ASIC3和SP表達檢測SP、ASIC3和PKC在正常組大鼠和炎性痛組大鼠觸液核均有表達，疼痛組觸液核物質(zhì)表達量均高于正常組（n=6，P＜0.05）。
　　 2、在體觸液核PKC、ASIC3和SP表達變化與動物痛行為的相關(guān)性PKC、ASIC3和SP抑制劑能減少相應(yīng)的物質(zhì)表達并能上調(diào)炎性痛大鼠痛閾值(n=6，P＜0.0

24、5)。
　　 3、PKC、ASIC3和SP在離體觸液神經(jīng)元細胞疼痛模型中表達時間曲線PKC、ASIC3和SP在本實驗細胞疼痛模型中表達高峰時間點一致，均出現(xiàn)在疼痛發(fā)生后6h，其后逐漸衰減（n=6，P＜0.05）。
　　 4、PKC、ASIC3和SP在細胞疼痛模型中的調(diào)控關(guān)系(1)給予ASIC3抑制劑后，ASIC3和SP表達水平均下降(n=6，P＜0.05)。
　　 (2)給予PKC的抑制劑后，PKC活化水平、AS

25、IC3和SP表達水平均下降(n=6，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、將觸液核部位的觸液神經(jīng)元進行原代培養(yǎng)，利用CB-FITC標(biāo)記觸液神經(jīng)元活細胞，并在離體條件下構(gòu)建觸液神經(jīng)元疼痛模型，是一種創(chuàng)新的、科學(xué)的研究手段，為深入研究觸液神經(jīng)元的生物學(xué)特征與功能奠定可靠的方法學(xué)基礎(chǔ);
　　 2、原代培養(yǎng)的觸液神經(jīng)元中有5-HT、GABA、ERK、c-Fos和TRPM8表達，且各種物質(zhì)在疼痛組表達量均明顯高于正常生

26、長組，說明上述物質(zhì)在觸液神經(jīng)元參與的疼痛中發(fā)揮了一定作用，這不僅是對本實驗室在體研究的有力佐證，亦進一步證實了用離體觸液神經(jīng)元疼痛模型研究疼痛發(fā)生機制的可靠性和科學(xué)性;
　　 3、PKC-ASIC3-SP在觸液神經(jīng)元參與的疼痛過程中發(fā)揮了調(diào)制作用，具體表現(xiàn)為:疼痛組大鼠PKC、ASIC3和SP表達量顯著高于正常組，通過抑制他們的表達能提高大鼠熱痛閾值，減輕疼痛;PKC可通過抑制ASIC3的活化減少SP的釋放。這是國內(nèi)外首次從細胞