串聯(lián)質(zhì)譜分析BLM誘導(dǎo)PF小鼠血中氨基酸與肉堿動態(tài)變化及精氨酸和正纈氨酸抗PF作用.pdf

1、肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）發(fā)病機制不清，目前尚無理想治療藥物。能量代謝可能參與PF發(fā)病。氨基酸和脂肪代謝是機體能量的主要來源。氨基酸和脂肪代謝在PF發(fā)病中的變化和作用未見報道。檢測外周血中氨基酸、游離肉堿和?；鈮A變化可以反映機體氨基酸、脂肪和有機酸代謝的狀況。
　　本課題目的在于探尋氨基酸和脂肪酸代謝在PF發(fā)病中的作用，以及外源性糾正紊亂代謝對PF的作用。研究分二部分進(jìn)行：第一部分先建立博萊霉素（bl

2、eomycin，BLM）誘導(dǎo)PF小鼠模型，采用LC-MS/MS技術(shù)分析外周血中氨基酸、游離肉堿和?；鈮A譜的動態(tài)變化，并分析與PF病程的相關(guān)性，期望明確與PF病理生理狀態(tài)相關(guān)的動態(tài)代謝物變化；第二部分研究L-精氨酸和L-正纈氨酸對BLM誘導(dǎo)小鼠PF的作用和機制，為尋找新的干預(yù)和治療PF藥物提供依據(jù)。
　　第一部分、串聯(lián)質(zhì)譜分析BLM誘導(dǎo)PF小鼠外周血中氨基酸和肉堿動態(tài)變化目的：研究氨基酸和脂肪酸代謝在BLM誘導(dǎo)小鼠PF發(fā)病中的變化

3、及作用。
　　方法：氣管內(nèi)灌注BLM誘導(dǎo)小鼠PF，于第3、7、14、21和28天，采用體重、肺系數(shù)、肺組織病理學(xué)和肺羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）等評價PF程度；采用LC-MS/MS技術(shù)檢測外周血中氨基酸和?；鈮A譜變化，并采用Pearson方法分析氨基酸和?；鈮A與PF發(fā)病的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　?、貰LM誘導(dǎo)PF小鼠體重明顯減輕，肺系數(shù)和HYP含量明顯升高。
　?、跉夤軆?nèi)灌注BLM小鼠第3

4、天，肺內(nèi)以炎性細(xì)胞浸潤為主；第7和14天，炎性細(xì)胞大量浸潤，少量膠原沉積；第21和28天，膠原大量沉積，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。
　?、跙LM誘導(dǎo)PF小鼠外周血中部分氨基酸及比值隨病程呈現(xiàn)動態(tài)改變：第3天，Ala、Tyr、Arg、Orn、Pro、Pro/Orn和Orn/Cit降低，Asp和Cit增高；第7天，Arg降低，Cit和Orn/Arg升高；第14天，Ala、Phe、Arg、Pro/Orn和 Glu/Cit降低，Cit、Orn、Pro

5、、Orn/Arg、Cit/Arg、Orn/Cit和Cit/Phe增高；第21天，Ala和Gly降低，Leu、Orn、His、Pro、Orn/Cit和His/Phe增高；第28天，Phe和Gly降低，Asp、Cit、Orn、Pro、Pro/Orn、Orn/Cit、His/Phe、Trp/Phe、Cit/Phe和Glu/Phe升高。
　?、蹷LM誘導(dǎo)PF小鼠外周血中部分?；鈮A及比值隨病程呈現(xiàn)動態(tài)改變：第3天，C12-OH、C12DC

6、、C16:1、C16-OH、C16:1-OH、C3/C2和C16-OH/C3升高；第7天，C12DC和C16:1降低；第14天，C4-OH、C3/C2、C3DC/C4和C4-OH/C2升高，C6/C3、C12/C3和C16-OH/C3降低；第21天，C0、C2、C3、C4、C4-OH、C4DC、C5、C5-OH、C8:2、C12DC、C14:1、C14:2、C18、C18DC和 C14：1/C16升高，C16/C2、C16/C3、C14

7、-OH/C3和C16-OH/C3降低；第28天，C3、C8:2、C10、C12、C12-OH、C12DC和C14升高；C4/C2、C4/C3、C5-OH/C3和C6/C3降低。
　?、莶糠治蓙y氨基酸和酰基肉堿與 PF發(fā)病有相關(guān)性。其中，Arg和C16-OH/C3與病程、肺系數(shù)、肺HYP、肺泡炎和纖維化評分均具有相關(guān)性。
　　小結(jié)：
　?、貰LM誘導(dǎo)PF小鼠，3天為急性炎癥期、7和14天為炎癥與纖維化交界期，21和28天

8、為纖維化期；
　?、谕庵苎邪被帷⒂坞x肉堿和?；鈮A隨PF病程發(fā)生動態(tài)變化，提示復(fù)雜的氨基酸代謝和脂肪酸代謝異常可能參與PF發(fā)??；
　?、跮C-MS/MS分析氨基酸和脂肪酸代謝動態(tài)變化可能為PF預(yù)測、診斷、病程活動性監(jiān)測及治療轉(zhuǎn)歸提供新的實驗室依據(jù)。
　　第二部分、L-精氨酸和L-正纈氨酸對BLM誘導(dǎo)小鼠PF的作用及機制
　　目的：研究精氨酸（L-Arg）和正纈氨酸（L-Nor）對BLM誘導(dǎo)小鼠PF的作用及機制

9、。方法：制備BLM誘導(dǎo)PF小鼠，并灌胃給予NS、L-Arg、L-Nor和L-Arg+L-Nor處理。于第3、14和28天，分析小鼠體重、肺系數(shù)、肺HYP、肺組織形態(tài)學(xué)變化；采用LC-MS/MS技術(shù)檢測血中Arg、Orn、Cit和Pro變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測血中γδT、Th17和Tregs細(xì)胞變化；生物化學(xué)方法檢測肺NO含量、iNOS、TNOS和Arginase活性變化；Western blot檢測肺iNOS與Arginase2蛋白表達(dá)。<

10、br>　　結(jié)果：
　?、貺-Arg和L-Nor合用治療PF小鼠14和28天可逆轉(zhuǎn)體重減輕、降低肺系數(shù)與肺HYP含量，還可明顯減輕肺組織病理學(xué)損傷和膠原沉積、降低肺泡炎和纖維化評分，且作用強于單用L-Arg和L-Nor。
　?、贚-Arg和L-Nor合用3、14和28天可顯著改善PF小鼠血中Arg、Cit、Orn、Pro、Orn/Cit、Pro/Orn的紊亂。
　　③L-Arg單用和合用L-Nor3、14和28天均可顯著

11、改善BLM誘導(dǎo)的Th17、Tregs和Tregs/Th17變化，L-Nor單用28天可改善PF小鼠外周血Th17、Tregs和Tregs/Th17變化。
　?、躄-Arg單用和合用L-Nor3天可顯著升高肺NO含量，L-Arg和L-Nor合用作用強于L-Arg單用。
　　⑤L-Nor單用14天可抑制Arginase活性和Arginase/TNOS，L-Arg和L-Nor合用3天可降低增高的iNOS和TNOS活性和升高Argi

12、nase/TNOS，14天可顯著降低Arginase活性和Arginase/TNOS。
　?、轕F小鼠3天肺iNOS蛋白量增高而Arginase2蛋白量降低，14和28天肺iNOS蛋白量變化不明顯而Arginase2蛋白量顯著增高；單用L-Arg可明顯降低小鼠3天肺iNOS蛋白量，L-Arg和L-Nor合用對肺Arginase2蛋白量有調(diào)節(jié)趨勢作用。
　　小結(jié)：L-Arg和L-Nor合用具有顯著地抗PF作用，可能與糾正PF病

13、程中Th17、Tregs和γδT細(xì)胞調(diào)控的Th1/Th2平衡異常，以及調(diào)節(jié)鳥氨酸循環(huán)中Arg經(jīng)NOS和Arginase的代謝平衡有關(guān)。
　　結(jié)論：
　?、貰LM誘導(dǎo)PF小鼠，3天為急性炎癥期、7和14天為炎癥與纖維化交界期，21和28天為纖維化期。
　　②外周血中氨基酸、游離肉堿和?；鈮A隨PF病程發(fā)生動態(tài)變化，提示復(fù)雜的氨基酸代謝和脂肪酸代謝異?？赡軈⑴cPF發(fā)??；
　?、跮C-MS/MS分析氨基酸和脂肪酸代謝動