t-AUCB調(diào)控Hsp27相關信號通路并誘導膠質(zhì)母細胞瘤凋亡的機制研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生率最高的惡性腫瘤，因血腦屏障的存在，以及膠質(zhì)瘤本身存在多種耐藥，其化療效果欠佳。既往研究表明，抑制熱休克蛋白27（Hsp27），能使可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑t-AUCB明顯發(fā)揮誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的作用。本研究以Hsp27為切入點，深入探討t-AUCB誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的相關機制，并闡明Hsp27激活導致的膠質(zhì)瘤細胞耐藥機制，為腦膠質(zhì)瘤的臨床診斷及治療提供新的靶點和理論依據(jù)。Notch信號通路已經(jīng)被證實與多種腫

2、瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移等存在密切關系，抑制Notch信號通路的γ-分泌酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元細胞肌動蛋白張力纖維形成過程中可以阻斷p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27通路活化，據(jù)此本文首先釆用γ-分泌酶抑制劑DAPT在p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27信號通路上游對膠質(zhì)母細胞瘤細胞進行對t-AUCB的敏感性研究；再通過抑制AKT，在p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27信號通路下游對膠質(zhì)母細胞瘤細胞進行t-AUCB的

3、敏感性研究；最后在膠質(zhì)瘤臨床標本中用免疫組織化學染色方法，發(fā)現(xiàn)Hsp27在高級別膠質(zhì)瘤中明顯高表達，對其與臨床預后的關系進行了分析。
　　第一部分抑制Hsp27活化對t-AUCB誘導凋亡的增強作用
　　目的旨在探索γ-分泌酶抑制劑DAPT是否能夠提高膠質(zhì)母細胞瘤對t-AUCB促凋亡作用的敏感性。
　　方法實驗分組：DMSO對照組、2μM DAPT處理組、200μM的t-AUCB處理組、2μM的DAPT預處理4小時后聯(lián)用

4、200μM的t-AUCB組。采用CCK-8細胞計數(shù)法，檢測DAPT及t-AUCB對膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和U87細胞增殖能力的作用，并以流式細胞技術分析細胞凋亡程度，Western Blot蛋白印跡法檢測p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27信號通路中p38MAPK,MAPKAPK2和Hsp27的磷酸化水平及Notch-1通路相關蛋白的表達。所有的數(shù)據(jù)均采用t檢驗進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果 DAPT在較低濃度（2μM）時就

5、能顯著增強t-AUCB介導的細胞增殖抑制作用，抑制p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27通路活化。DAPT及t-AUCB聯(lián)合用藥能夠使U251和U87的凋亡率分別從4.5±1.8％和5.1±1.5%增加至21.9±3.6%和20.8±2.1%(P<0.01)。免疫印跡法檢測顯示，t-AUCB處理后p38MAPK,MAPKAPK2和Hsp27的磷酸化水平均明顯增加，而在DAPT聯(lián)合應用t-AUCB的細胞中，磷酸化水平顯著降低，DAP

6、T可顯著抑制Hsp27磷酸化。
　　結(jié)論 DAPT通過抑制p38MAPK/MAPKAPK2/Hsp27通路的活化，抑制了t-AUCB誘導的Hsp27通路的活化，發(fā)揮了t-AUCB對膠質(zhì)瘤細胞的誘導凋亡作用，二者聯(lián)合應用可增加對膠質(zhì)瘤細胞的殺傷力，靶向阻斷Hsp27信號通路，促進膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。
　　第二部分抑制由Hsp27導致的AKT活化能增強t-AUCB的誘導凋亡作用
　　目的驗證t-AUCB處理細胞后導致的Hsp

7、27磷酸化是否引起AKT的磷酸化，抑制AKT磷酸化水平能否促進t-AUCB誘導細胞凋亡，并評估同時抑制Hsp27和AKT的磷酸化對膠質(zhì)母細胞瘤細胞產(chǎn)生的生長抑制效應。
　　方法采用膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251和LN443，用藥分組為DMSO對照組、t-AUCB組、Hsp27抑制劑KRIBB3組、AKT抑制劑IV組、KRIBB3聯(lián)合應用t-AUCB組、IV聯(lián)合應用t-AUCB組，以及KRIBB3與IV、t-AUCB聯(lián)合應用組，細胞增殖

8、能力通過CCK-8試劑盒進行檢測；流式細胞技術分析不同組別細胞凋亡率的差異；western blot法檢測AKT磷酸化水平；RNA干擾技術下調(diào)Hsp27的基因表達，以判斷AKT磷酸化水平是否依賴于Hsp27的磷酸化激活。實驗數(shù)據(jù)均采用t檢驗的方法進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果與對照組相比，Hsp27與AKT在U251中的磷酸化水平在200μM t-AUCB作用48小時后明顯升高，然而10μM KRIBB3預處理1小時后聯(lián)合應用200μM

9、 t-AUCB作用并沒有明顯的促進 Hsp27和 AKT的磷酸化。LN443細胞中200μM t-AUCB作用后，原先的Hsp27與AKT的磷酸化水平均有所增加，但是無論是否使用t-AUCB處理，Hsp27的siRNA均能夠顯著降低Hsp27磷酸化水平。單用200μM t-AUCB，細胞凋亡不明顯，U251凋亡率10.5±1.5%，LN443凋亡率9.7±1.2%；單獨使用0.5μM AKT抑制劑IV作用也沒有顯示出明顯的細胞凋亡率改變

10、，U251凋亡率為12.1±1.3%，LN443凋亡率為11.8±1.2%；而0.5μM AKT抑制劑IV預處理1小時后聯(lián)合應用200μM t-AUCB作用72小時后，U251凋亡率增至24.5±2.1%，LN443凋亡率增至20.1±1.4%。200μM t-AUCB對細胞增殖有抑制作用，而KRIBB3、AKT抑制劑IV與t-AUCB聯(lián)合作用下U251和LN443細胞增殖受到更強的抑制，Akt抑制劑IV和KRIBB3聯(lián)合預處理組與單獨

11、預處理組相比，t-AUCB的細胞增殖抑制作用被明顯增強。
　　結(jié)論磷酸化Hsp27介導的AKT磷酸化能夠引起膠質(zhì)母細胞瘤細胞對t-AUCB誘導凋亡的抵抗。抑制Hsp27和/或AKT的磷酸化或活性，能顯著減弱細胞對t-AUCB的抵抗，從而促進t-AUCB對膠質(zhì)瘤細胞的誘導凋亡作用。
　　第三部分 Hsp27、MGMT和Oct4在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義
　　目的通過檢測Hsp27、MGMT和Oct4在膠質(zhì)瘤臨床標本中

12、的表達，分析臨床病理級別與三者之間的相關性，在已知 MGMT臨床應用的前提下，探討 Hsp27和Oct4在膠質(zhì)瘤臨床治療中可能的應用價值。
　　方法1、40例星形細胞瘤，其中WHOⅡ級12例，WHOⅢ級12例，WHOⅣ級16例。2、SP免疫組織化學染色法對標本進行染色，半定量法評估免疫組化結(jié)果。3、采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。用χ2檢驗或FISH精確檢驗法分析Hsp27、MGMT以及Oct4三種分子標志物在不同級別腫瘤

13、中的表達差異及其與患者性別、復發(fā)、放化療的臨床病理因素之間的關聯(lián)；Spearman等級相關分析用于研究三種指標在膠質(zhì)瘤中表達的相關性。
　　結(jié)果 Hsp27、MGMT和Oct4在高級別星形細胞瘤（WHOⅢ/Ⅳ級）表達率分別為85.7%、53.6%和75%，低級別星形細胞瘤（WHOⅡ級）表達率分別為16.7%、16.7%和25%。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，高級別星形細胞瘤（WHOⅢ/Ⅳ級）與低級別星形細胞瘤（WHOⅡ級）相比，其 Hsp2

14、7、MGMT以及 Oct4的表達率明顯增高；Hsp27的表達與患者性別、是否行放化療無關，但是與腫瘤復發(fā)與否顯著相關；MGMT的表達與患者性別、腫瘤復發(fā)、放化療均無關；Oct4的表達與患者性別無關，但與腫瘤復發(fā)、放化療顯著相關；星形細胞瘤中Hsp27與Oct4的表達有明顯正相關。
　　結(jié)論 Hsp27與Oct4均在惡性膠質(zhì)瘤中高表達，且兩者的表達呈正相關，兩者可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展或者其耐受抗腫瘤藥物過程中存在聯(lián)系，為進一步研究兩