HSP70沉默對缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　采用RNA干涉技術(shù)沉默神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SH-SY5Y）熱休克蛋白70（HSP70)的表達(dá)，觀察HSP70沉默對缺氧誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡及BAG-1、NF-κB、caspase-3表達(dá)的影響。
　　方法：
　　培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞至對數(shù)生長期，采用RNA干涉技術(shù)沉默HSP70，將SH-SY5Y細(xì)胞分為4組，分別為細(xì)胞對照組（正常的SH-SY5Y細(xì)胞)、慢病毒對照組（感染含GFP但不含靶向HSP7

2、0 siRNA的慢病毒)、慢病毒感染組Ⅰ（感染含GFP及靶向HSP70 siRNA-Ⅰ的慢病毒)、慢病毒感染組Ⅱ（感染含GFP及靶向HSP70 siRNA-Ⅱ的慢病毒)。采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western blotting)檢測缺氧處理后HSP70蛋白表達(dá)水平；實(shí)時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR)檢測HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。4組細(xì)胞分別缺氧4h、8h、12h后再復(fù)氧24h，采用CCK-8法檢測SH-SY5Y細(xì)胞生

3、長與增殖情況。選擇8h為最佳缺氧時間，流式細(xì)胞儀檢測分析SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期；qRT-PCR檢測缺氧8h時SH-SY5Y細(xì)胞BAG-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平；Western blotting檢測缺氧8h時SH-SY5Y細(xì)胞BAG-1、NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.重組慢病毒siRNA-Ⅰ感染組和重組慢病毒siRNA-Ⅱ感染組HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別低于細(xì)胞對照組和慢病毒對

4、照組（2-△△ct為1.00±0.04，0.98±0.12，0.22±0.03，0.15±0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。重組慢病毒siRNA-Ⅰ感染組和重組慢病毒siRNA-Ⅱ感染組HSP70蛋白表達(dá)水平分別低于細(xì)胞對照組和慢病毒對照組（灰度值分別為1.31±0.23，1.26±0.17，0.77±0.10，0.80±0.17)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　　2.隨缺氧時間的延長，4組細(xì)胞的細(xì)胞活性先

5、增強(qiáng)，在缺氧8h時細(xì)胞活性達(dá)高峰，隨后各組細(xì)胞活性均有下降的趨勢。缺氧8h時，重組慢病毒 siRNA-Ⅰ感染組及重組慢病毒siRNA-Ⅱ感染組細(xì)胞活性均低于細(xì)胞對照組及慢病毒對照組（OD值分別為0.85±0.02，0.84±0.03，0.23±0.03，0.25±0.02，P＜0.05)。
　　3.與細(xì)胞對照組和慢病毒對照組比較，重組慢病毒siRNA-Ⅰ感染組及重組慢病毒siRNA-Ⅱ感染組細(xì)胞凋亡均顯著升高（細(xì)胞凋亡率（%)分別

6、為11.17±1.12，11.40±0.40，68.97±6.82，58.10±3.16，P＜0.05)。
　　4.與細(xì)胞對照組和慢病毒對照組比較，重組慢病毒siRNA-Ⅰ感染組及重組慢病毒 siRNA-Ⅱ感染組BAG-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異（2-△△ct為1.00±0.06，0.94±0.07，0.92±0.05，0.91±0.09，P＞0.05)；重組慢病毒 siRNA-Ⅰ感染組及重組慢病毒siRNA-Ⅱ感染組與細(xì)胞對

7、照組和慢病毒對照組比較，BAG-1蛋白表達(dá)水平無顯著差異（BAG-1L灰度值分別為0.96±0.10，0.99±0.03，1.03±0.02，1.02±0.07，P＞0.05；BAG-1M灰度值分別0.95±0.03，0.98±0.05，1.02±0.09，1.00±0.01，P＞0.05；BAG-1S灰度值分別1.02±0.04，1.00±0.07，1.03±0.07，0.96±0.04，P＞0.05)；NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高

8、（灰度值分別為1.00±0.00，1.01±0.08，1.95±0.22，2.03±0.16，P＜0.05)；caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（灰度值分別為0.82±0.04，0.83±0.03，1.19±0.04，1.21±0.04，P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　HSP70沉默可促進(jìn)缺血缺氧SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，降低SH-SY5Y細(xì)胞活力，增加NF-κB、caspase-3的蛋白表達(dá)水平，但對BAG-1蛋白表達(dá)