細(xì)胞骨架成核劑Cordon-bleu對腎小管上皮細(xì)胞初級纖毛結(jié)構(gòu)與功能的影響.pdf

1、研究目的:
　　本研究主要驗(yàn)證常染色體顯性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidneydisease，ADPKD)中是否存在細(xì)胞骨架蛋白成核劑cordon-bleu(Cob1)的表達(dá)異常，并探討Cob1異常對初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能影響的可能機(jī)制，從而進(jìn)一步了解和豐富初級纖毛致病假說，為臨床上尋找多囊腎病新靶標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.常染色體顯性多囊腎病中Cob1表達(dá)差異

2、、初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能異常的生物學(xué)驗(yàn)證
　　(1)運(yùn)用Western blot及Real-time PCR方法檢測人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞(WT9-12)與正常人腎小管上皮細(xì)胞(RCTEC)中、多囊腎病動物模型pkd1條件敲除小鼠（pkd1-/-）與正常對照小鼠（pkd1+/+）腎臟組織中Cob1的表達(dá)差異。
　　(2)運(yùn)用免疫組化方法觀察WT9-12與RCTEC以及pkd1-/-與pkd1+/+腎臟組織中Cob1的定位變化情

3、況。
　　(3)利用激光共聚焦顯微鏡觀察WT9-12與RCTEC中初級纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。
　　(4)運(yùn)用Real-time PCR方法檢測WT9-12及RCTEC中KIF3A、IFT88的表達(dá)差異。
　　2.細(xì)胞骨架紊亂對基體(basal body，BB)的遷移定位以及初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究
　　(1)采用免疫熒光方法觀察WT9-12與RCTEC中、pkd1-/-與pkd1+/+腎臟組織中F-actin形態(tài)

4、結(jié)構(gòu)差異。
　　(2)通過免疫熒光染色方法觀察經(jīng)細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B，CB)處理的RCTEC細(xì)胞中F-actin、初級纖毛的變化情況以及基體的定位。
　　(3)利用掃描電鏡觀察經(jīng)CB處理的RCTEC細(xì)胞形態(tài)及初級纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　3.Cob1異常對初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究
　　(1)運(yùn)用Western blot及Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1的RCTEC中

5、Cob1、Pacsin2、KIF3A表達(dá)變化情況。
　　(2)運(yùn)用Western blot及Rea1-time PCR方法檢測經(jīng)siRNA干擾下調(diào)Cob1表達(dá)的RCTEC中Cob1、Pacsin2、KIF3A表達(dá)變化情況。
　　(3)利用激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1及siRNA干擾下調(diào)Cob1的RCTEC中F-actin、基體及初級纖毛形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況。
　　(4)采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1及

6、siRNA干擾下調(diào)Cob1的RCTEC中細(xì)胞增殖變化情況。
　　(5)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1及siRNA干擾下調(diào)Cob1的RCTEC中胞內(nèi)鈣離子濃度變化。
　　(6)通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察質(zhì)粒過表達(dá)Cob1及siRNA干擾下調(diào)Cob1的RCTEC中細(xì)胞遷移變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.常染色體顯性多囊腎病中Cob1表達(dá)差異、初級纖毛的結(jié)構(gòu)和功能異常的生物學(xué)驗(yàn)證
　　(1)運(yùn)用Western b

7、lot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)WT9-12中Cob1表達(dá)較RCTEC明顯增多;pkd1-/-小鼠腎臟組織中亦得到相同結(jié)果。
　　(2)通過免疫組化方法觀察發(fā)現(xiàn)在RCTEC中Cob1主要定位于細(xì)胞核，而WT9-12的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有Cob1分布;pkd1-/-及pkd1+/+小鼠腎臟組織中Cob1主要于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，并且在pkd1-/-靠近管腔側(cè)異常增多。
　　(3)利用激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)WT9-1

8、2中初級纖毛數(shù)量較RCTEC少，纖毛長度明顯變短甚至消失。
　　(4)運(yùn)用Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)WT9-12中KIFA3及IFT88表達(dá)較RCTEC明顯減少;pkd1-/-小鼠腎臟組織中亦得到相同結(jié)果。
　　2.細(xì)胞骨架紊亂對基體(basal body，BB)的遷移、定位以及初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究
　　(1)免疫熒光發(fā)現(xiàn)WT9-12胞漿中F-actin解聚變短，F(xiàn)-actin小體增多，呈現(xiàn)骨架彌散

9、狀態(tài)，而RCTEC胞漿中F-actin聚合形成粗大的F-actin束貫通于細(xì)胞內(nèi);與pkd1+/+小鼠相比，pkd1-/-小鼠腎臟組織中F-actin在腎小管上皮細(xì)胞胞漿靠近管腔側(cè)異常沉積。
　　(2)激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)CB處理RCTEC0h、1h、2h、6h后，胞漿中F-actin隨處理時(shí)間延長解聚增加，初級纖毛長度變短甚至消失。
　　(3)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)CB處理后，RCTEC中初級纖毛隨干擾時(shí)間延長長度變短甚至消失

10、，細(xì)胞縮小。
　　3.Cob1異常對初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能的影響研究
　　(1) Western blot及Real-time PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1后KIF3A表達(dá)下調(diào);RCTEC經(jīng)siRNA干擾下調(diào)Cob1后KIF3A表達(dá)增多。
　　(2)激光共聚焦發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1后F-actin聚合增加，初級纖毛長度變長;RCTEC經(jīng)siRNA干擾下調(diào)Cob1后F-actin解聚增加，

11、F-actin含量減少，基體遷移障礙，初級纖毛長度變短甚至消失。
　　(3) MTT法檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1后抑制細(xì)胞增殖，RCTEC經(jīng)siRNA干擾下調(diào)Cob1后促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加，RCTEC經(jīng)siRNA干擾下調(diào)Cob1后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少。
　　(5)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)RCTEC轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)Cob1后細(xì)胞遷移

12、增加、方向一致;RCTEC經(jīng)siRNA干擾下調(diào)Cob1后細(xì)胞遷移能力減弱、方向紊亂。
　　研究結(jié)論:
　　本研究結(jié)果顯示，人多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞及多囊腎病小鼠模型中均存在細(xì)胞骨架蛋白成核劑Cob1表達(dá)上調(diào)，以及初級纖毛結(jié)構(gòu)和功能異常。Cob1異常可影響F-actin的聚合作用，導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂，從而抑制基體正常遷移至細(xì)胞膜頂端，最終導(dǎo)致初級纖毛長度變短。上調(diào)Cob1表達(dá)能改善F-actin聚合作用，促進(jìn)基體遷移至細(xì)胞膜