基于高能氧通道的量子點(diǎn)均相免疫熒光分析方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　標(biāo)記免疫學(xué)，就是將標(biāo)記技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行分析測(cè)定的一門學(xué)科，是集基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和臨床應(yīng)用于一體的學(xué)科，其基本原理是通過(guò)熒光素、酶、放射性核素或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗體或抗原，將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性與各標(biāo)記物的高靈敏、可測(cè)量性相結(jié)合，以檢查體內(nèi)各種生物活性物質(zhì)的活性和濃度。常用的標(biāo)記免疫學(xué)分析方法包括免疫熒光、酶免疫測(cè)定、免疫組化、放射免疫測(cè)定、化學(xué)發(fā)光免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫等。隨著標(biāo)記技術(shù)、單克隆抗體

2、技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，標(biāo)記免疫學(xué)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境及食品檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)時(shí)，待測(cè)物是否均勻分散在液相體系中，可以將免疫分析技術(shù)分為均相免疫分析和非均相免疫分析。當(dāng)中，常用的均相免疫分析方法有AlphaScreen、TRACE、LANCE。目前國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于臨床的免疫診斷主要是傳統(tǒng)的非均相分析，例如ELISA、快速試紙條法等。一般而言，傳統(tǒng)非均相分析的操作步驟繁瑣、免疫反應(yīng)體系緩慢、需要通過(guò)洗滌

3、來(lái)分離結(jié)合的與未結(jié)合的抗原或抗體、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、不易自動(dòng)化等缺點(diǎn)。與之相比，均相免疫分析技術(shù)因?yàn)槭s了洗滌的步驟，可以減少操作帶來(lái)的誤差，通常具有靈敏度高、背景熒光值低、信噪比高、應(yīng)用范圍廣、性質(zhì)穩(wěn)定、便于操作、易于微型化自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。
　　甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)又稱甲種胎兒球蛋白，人類的甲胎蛋白是由4號(hào)染色體長(zhǎng)臂的AFP基因所編碼的一種單鏈多肽糖蛋白。甲胎蛋白是主要在胎兒發(fā)育過(guò)程中，由卵黃囊和肝臟分泌，并經(jīng)

4、由腎臟排入尿液和羊水，并通過(guò)胎盤進(jìn)入母體血液之中的白蛋白。甲胎蛋白的濃度峰值出現(xiàn)在胎兒時(shí)期，之后在8至12個(gè)月逐漸降低，并降至健康成人水平。正常情況下，甲胎蛋白濃度維持在低水平。如果母體血清或羊水中甲胎蛋白的濃度異常，提示胎兒可能發(fā)育異常，比如神經(jīng)管缺損、腸道閉鎖、先天性腎病變、胎兒窘迫、死胎等。因此，雖然甲胎蛋白是一項(xiàng)非特異性指標(biāo)，但母體血清或羊水的中甲胎蛋白濃度依然可以作為胎兒畸形的篩選指標(biāo)。臨床上還常聯(lián)合其他檢測(cè)指標(biāo)，將其應(yīng)用于出

5、生缺陷的產(chǎn)前篩查和診斷，以期對(duì)疾病實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，有助于減少死亡率、提高存活率和大力普及優(yōu)生優(yōu)育。另外，由于肝細(xì)胞癌、卵黃囊和胚胎性腫瘤及部分肝外腫瘤患者可重新合成甲胎蛋白，諸多肝病皆可以伴有甲胎蛋白濃度的升高，因此甲胎蛋白常用于原發(fā)性肝癌或是其他非肝癌惡性腫瘤，包括消化、呼吸、泌尿生殖等多系統(tǒng)器官惡性腫瘤的臨床輔助檢測(cè)指標(biāo)。其次，甲胎蛋白還常用于肝炎、肝硬化等急慢性肝病診斷、病理變化和病程預(yù)后的監(jiān)測(cè)。
　　量子點(diǎn)(Quant

6、um Dots，QDs)是一種把粒子在三個(gè)空間方向上限制束縛住的具有量子限域效應(yīng)的半導(dǎo)體納米結(jié)構(gòu)材料。它具有較寬激發(fā)譜、窄而對(duì)稱的發(fā)射峰、抗光漂白性、Stokes位移大、較高量子產(chǎn)率、摩爾消光系數(shù)大等諸多光學(xué)特性，使之有望成為新型的熒光標(biāo)記物用于現(xiàn)代均相免疫分析技術(shù)中。
　　氧通道技術(shù)(Luminescent oxygen channeling assay，LOCI)是均相免疫分析方法的一種，其特點(diǎn)是感光微球被激發(fā)光激發(fā)后的，能把

7、周邊溶液中的氧分子變成高能的單線態(tài)氧，并以此為載體進(jìn)行信號(hào)傳遞，與傳統(tǒng)的非均相免疫分析相比，省去洗滌的步驟，能有更高的靈敏度。
　　方法：
　　本文旨在利用脂溶性的半導(dǎo)體量子點(diǎn)納米材料，構(gòu)建功能性發(fā)光微球，結(jié)合高能氧通道技術(shù)，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理下，以甲胎蛋白為例，建立一種新型的基于量子點(diǎn)的高能氧通道均相熒光免疫分析方法并探索其初步應(yīng)用。
　　主要的研究工作包括以下幾個(gè)方面:1.發(fā)光微球的構(gòu)建與表面化學(xué)修飾:本研究

8、通過(guò)化學(xué)溶劑生長(zhǎng)法合成出具有核/殼結(jié)構(gòu)的硒化鎘/硫化鋅脂溶性量子點(diǎn)和能接收單線態(tài)氧的噻嗪化合物1-苯胺基，2-苯基氧硫雜環(huán)己烯(N，N-dimethyl-4-(2-phenyl-5，6-dihydro-1，4-oxathiin-3-yl)benzenamine，thioxene)。然后通過(guò)有機(jī)溶劑溶脹法，把量子點(diǎn)、噻嗪化合物和天線材料9，10-雙（苯乙炔基）蒽(9，10-Bis(phenylethynyl) anthracene，BPE

9、A)包埋在羧基化聚苯乙烯微球里，構(gòu)建量子點(diǎn)發(fā)光微球，并通過(guò)化學(xué)修飾降低其表面非特異性吸附，同時(shí)在交聯(lián)劑1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide，EDC）和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide，Sulfo-NHS)的作用下把抗甲胎蛋白的一株單克隆抗體E014，通過(guò)羧基與氨基的脫水縮合成肽反應(yīng)，將其偶聯(lián)在發(fā)光

10、微球表面，構(gòu)建功能性量子點(diǎn)發(fā)光微球。2.感光微球的構(gòu)建與表面修飾:本研究合成光敏性材料BTHS酞青化合物（二（三己基硅氧基）-2，9，16，23-四正丁基-29，31-二氫酞青-硅烷），并通過(guò)熱溶脹法包埋在聚苯乙烯微球內(nèi)，構(gòu)建成感光微球。然后同樣對(duì)感光微球表面進(jìn)行化學(xué)修飾以降低其非特異吸附性，并在EDC、Sulfo-NHS的作用下與鏈霉親和素(Streptavidin，Sav)相偶聯(lián)，構(gòu)建功能性感光微球。3.免疫檢測(cè):用生物素標(biāo)記抗甲胎

11、蛋白的另一株單克隆抗體E010，通過(guò)生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，雙抗體夾心法，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，構(gòu)建免疫檢測(cè)方法。用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將AFP抗原配制成0 IU/mL、1 IU/mL、10 IU/mL、100IU/mL、500 IU/mL、1000 IU/mL系列濃度，用分析緩沖液把功能性感光微球、發(fā)光微球的濃度調(diào)整為0.1 mg/mL。用生物素標(biāo)記AFP的另一株單克隆抗體E010，并調(diào)整濃度為5μg/mL。把25μL的發(fā)光微球、AFP抗原、生物

12、素化抗體混合，37℃震蕩孵育15分鐘后，避光，加入175μL感光微球，37℃繼續(xù)孵育15分鐘后，用680 nm的光源激發(fā)感光微球，檢測(cè)605 nm處的熒光信號(hào)強(qiáng)度。并以自制試劑中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，信號(hào)值1×103計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化:具體包括發(fā)光微球包埋條件的優(yōu)化、發(fā)光微球選用天線材料的優(yōu)化、發(fā)光微球上樣量、免疫反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化等。
　　結(jié)果：
　

13、　采用雙抗體夾心法，兩株單克隆抗體與AFP抗原形成抗原抗體免疫復(fù)合物，并拉近觀光微球和發(fā)光微球的距離，實(shí)現(xiàn)單線態(tài)氧的傳遞，經(jīng)過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使量子點(diǎn)發(fā)射信號(hào)熒光。通過(guò)檢測(cè)量子點(diǎn)的熒光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)其信號(hào)強(qiáng)度與反應(yīng)體系中AFP抗原濃度呈線性相關(guān)，其工作曲線為L(zhǎng)ogY=2.401+1.052·LogX(R2=0.959，P＜0.01)，分析靈敏度為2.65 IU/mL。該新型均相免疫分析方法不需沖洗掉未結(jié)合的熒光標(biāo)記物，靈敏度高，可為今后實(shí)