絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料研究.pdf

1、對于骨折的治療，經(jīng)歷了由堅(jiān)強(qiáng)固定到生物學(xué)固定的過程。骨折治療理念的進(jìn)步對骨內(nèi)植物提出了新的要求。傳統(tǒng)的釘板系統(tǒng)存在感染、應(yīng)力遮擋、釘板移位以及主觀疼痛或感覺異常等問題。大約12％頜面部骨折患者術(shù)后需要二次手術(shù)拆除內(nèi)固定，隨著可吸收高分子聚合物材料研究的發(fā)展，如聚乙酸，聚羥基乙酸，聚乙酸乙醇酸可吸收接骨板和螺絲釘?shù)膽?yīng)用等均可降低二次手術(shù)的風(fēng)險，并且可以逐漸把應(yīng)力轉(zhuǎn)移到愈合的骨頭上從而促進(jìn)骨再生。這些潛在的好處說明可吸收材料在治療骨折時的樂

2、觀前景。但這些可吸收材料也存在觸感明顯，局部自限性炎癥反應(yīng)，感染和內(nèi)固定需再次拆除等問題。
　　絲素蛋白材料是美國FDA批準(zhǔn)的，具有堅(jiān)強(qiáng)的力學(xué)性能，良好的生物相容性的可降解生物材料，可以在超過170℃環(huán)境維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以被高溫高壓滅菌，在極端pH值下也很穩(wěn)定。根據(jù)既往文獻(xiàn)報道絲素蛋白材料具有成為制備新型的醫(yī)用可降解生物材料的良好潛能。但高強(qiáng)度的絲素蛋白材料制作過程包括各種化學(xué)試劑處理，通過溫度、濃度等實(shí)驗(yàn)條件改變誘導(dǎo)絲素蛋白內(nèi)部

3、分子結(jié)構(gòu)的排布，如從無規(guī)蜷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結(jié)構(gòu)等，從而提高材料的強(qiáng)度，材料加工過程中不可避免的會加入有害化學(xué)試劑如甲醇，六氟異丙醇等，因此加工工藝是否會導(dǎo)致有害物質(zhì)殘留，相關(guān)物理化學(xué)性能改變而影響其良好的生物相容性和力學(xué)性能仍需要進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　本研究以制備高強(qiáng)度、可吸收且具有良好生物相容性的絲素骨科內(nèi)固定材料為目的，在文獻(xiàn)學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上摸索改進(jìn)材料制備條件和工藝，詳細(xì)探討了新制備材料的基本性質(zhì)，并從體外細(xì)胞形態(tài)觀

4、察，細(xì)胞毒性，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，血液相容性等角度初步評價了絲素骨科內(nèi)固定材料的體外生物相容性，為后期動物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.材料的制備:主要包括蠶絲脫膠、洗滌、干燥、蠶絲溶解、絲素混合溶液透析、溶液離心、冷凍凍干、再次溶解真空干燥的絲素纖維。絲素螺釘模具制作、甲醇置換、梯度換水、干燥、后期加工絲素螺釘及絲素固定板。
　　2.材料的基本性質(zhì):通過生物力學(xué)機(jī)器測定三點(diǎn)彎，剪切力及彈性模量數(shù)據(jù);通

5、過接觸角測量儀測定材料表面接觸角;通過掃描電鏡觀察材料表面及橫斷面的微觀結(jié)構(gòu)，并用X線衍射儀及能譜分析儀檢測材料表面的主要成分及元素組成;通過pHS-2C數(shù)字式酸度計測定浸提液的pH值;通過計算平衡鹽溶液浸泡前后絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料重量的改變，材料直徑的變化評價吸水膨脹性能;通過計算體外蛋白酶XIV處理下不同時間點(diǎn)材料重量改變評價降解性能;通過螺釘植入家兔股骨中評價絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料術(shù)中的可植入性能。
　　3.生物相容性試驗(yàn)

6、:按照ISO10993-12標(biāo)準(zhǔn)制備材料浸提液并培養(yǎng)細(xì)胞小鼠前成骨細(xì)胞，空白對照組采用含10％FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用鈣黃綠素死活細(xì)胞染色、細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)含量測定判斷有無細(xì)胞毒性，倒置顯微鏡觀察與材料共培養(yǎng)（或者與材料浸提液共培養(yǎng)）的細(xì)胞形態(tài)，CCK-8法檢測材料及其浸提液對細(xì)胞相對增殖率的影響，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)評價材料對細(xì)胞凋亡和壞死過程的影響，溶血試驗(yàn)判斷材料對血液紅細(xì)胞有無溶血反應(yīng)，根據(jù)上述結(jié)果綜合評價絲素

7、蛋白骨科內(nèi)固定材料的生物安全性。
　　結(jié)果：
　　1.材料的表征
　　1.1 通過生物力學(xué)機(jī)器測定絲素圓柱棒最大剪切應(yīng)力為42.6±13.5MPa。其抗彎強(qiáng)度達(dá)67.2±8.4MPa，彈性模量為8.1±1.1 GPa;與金屬材料相比其彈性模量更接近骨骼本身的彈性模量;通過植入家兔股骨試驗(yàn)，共在12只家兔體內(nèi)植入24枚螺釘，均成功植入，后期觀察除了其中一只家兔右后腿跛行外，其余家兔行走均良好。前三個月標(biāo)本取出后可見螺釘仍

8、牢固固定在股骨干內(nèi)，未發(fā)生脫出或移位等情況，材料與骨質(zhì)接觸表面良好，未見顏色改變等不良反應(yīng)。
　　1.2 通過接觸角測量儀測定材料表面接觸角為95.8±8.5°，提示材料表面疏水。
　　1.3 電子掃描電鏡觀察材料表面均勻，結(jié)構(gòu)致密。能譜分析儀結(jié)果提示該材料主要由碳、氮、氧、鈣組成，其中碳元素原子百分比約為62.81％，氮元素約占14.69％，氧元素約占22.40％，鈣元素約占0.1％。
　　1.4 絲素蛋白骨科內(nèi)固定

9、材料吸水膨脹性能:浸泡10min時材料重量已經(jīng)開始增加，并且在2h開始，吸水速度開始增快，并且最終在PBS中浸泡48h后基本達(dá)到飽和，其最大吸水率達(dá)30.7±0.3％，后期隨著浸泡時間延長，吸水率未發(fā)生明顯改變。材料吸水后直徑也隨著浸泡時間延長而不斷增加，其中直徑增長速度也是在浸泡2h后開始增加，并在浸泡48h時間點(diǎn)附近直徑增大最高達(dá)17.9±1.5％。
　　1.5 體外蛋白酶XIV降解試驗(yàn)提示材料的降解曲線擬合符合二階函數(shù)規(guī)律，

10、y=0.00087x2+0.2003x-0.495，R2=0.98，根據(jù)公式可以推導(dǎo)材料可在體外酶環(huán)境下降解3個月重量減少百分比為24.57％，體外完全降解需要8個月時間。
　　1.6 通過pHS-2C數(shù)字式酸度計測定浸提液的pH值可得到隨著浸泡時間的延長，其PH值未發(fā)生明顯波動趨勢，最終穩(wěn)定在7.0-7.2之間。
　　2.材料的生物相容性
　　2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn):絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料浸提液與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)

11、合培養(yǎng)24h后，LDH活性測定，材料浸提液組與空白對照組分別為(963.0±90.0) U/L，(882.4±106.0) U/L，兩組數(shù)據(jù)之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);鈣黃綠素死活細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)（綠染為活細(xì)胞，紅染為死細(xì)胞）可見絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料周邊細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞形體正常，鋪展良好，高倍鏡下可見細(xì)胞伸展性良好，未見明顯死細(xì)胞。以上結(jié)果提示材料無明顯細(xì)胞毒性。
　　2.2 形態(tài)觀察:絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料及其浸提液分

12、別與MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)48h后，倒置熒光顯微鏡下觀察材料及其浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁良好，呈正常生長，形態(tài)呈梭形，胞漿內(nèi)可見少量離散的黑色顆粒，未見明顯細(xì)胞溶解等，符合0級標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):細(xì)胞與材料共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組OD值逐漸升高，雖然不同時間點(diǎn)材料共培養(yǎng)組的OD值均低于空白對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而在細(xì)胞與材料浸提液共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)時間的延長，各組0D值逐漸升

13、高，但實(shí)驗(yàn)組與空白對照組的OD值基本相等，未見統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);
　　2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn):絲素蛋白組壞死率為3.0％，凋亡率為2.3％;空白對照組壞死率為2.0％，凋亡率為2.9％;陽性對照組壞死率為3.5％，凋亡率為6.4％。材料共培養(yǎng)組與空白對照組的細(xì)胞凋亡率和壞死率沒有顯著性差異。說明絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料不會導(dǎo)致小鼠成骨細(xì)胞的凋亡或壞死。
　　2.5 溶血實(shí)驗(yàn)檢測絲素蛋白骨科內(nèi)固定材料的溶血率為1.9％，

14、其溶血率符合可植入醫(yī)用材料的安全標(biāo)準(zhǔn)(＜5％)。
　　結(jié)論：
　　1.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料具有良好的生物力學(xué)強(qiáng)度，且與臨床應(yīng)用廣泛的金屬材料對比其彈性模量更接近骨骼本身的彈性模量，是一種新型的高強(qiáng)度可吸收生物材料，具有較大的臨床應(yīng)用價值。
　　2.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料吸水速率較慢，可滿足臨床醫(yī)生術(shù)中操作要求;降解周期長，具有為骨折愈合提供良好固定的潛力。
　　3.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料

15、表面具有疏水性，不利于細(xì)胞粘附;但材料周邊細(xì)胞生長正常，與材料或其浸提液共培養(yǎng)均未見明顯細(xì)胞毒性，材料不影響細(xì)胞增殖，對細(xì)胞凋亡未見明顯不良影響。
　　4.本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料溶血率低于5％，具有良好的血液相容性。因此本課題制備的絲素骨科內(nèi)固定材料是一種生物相容性好，機(jī)械強(qiáng)度高，可緩慢生物降解，且降解產(chǎn)物不會對細(xì)胞機(jī)體產(chǎn)生不利影響的生物材料，具有容易植入，塑形良好，能在骨骼中保持8周以上的特征，所有這些特性都展示出其在生