神經(jīng)元的發(fā)育與絲素蛋白材料結(jié)合的研究.pdf

1、神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機(jī)能單位，神經(jīng)的損傷或疾病引起的神經(jīng)元的變性、退化或喪失是不能或很難再生的。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)至今仍無(wú)有效的治療方法，因此尋找理想的治療方法是當(dāng)前研究的重要課題。目前研究較多的是用神經(jīng)干細(xì)胞移植(NSCs)的方法來(lái)代替受損細(xì)胞，但是研究表明移植入的細(xì)胞到達(dá)損傷部位的為數(shù)很少，而對(duì)NSCs的分化機(jī)制也尚不清楚，且誘導(dǎo)NSCs定向分化的調(diào)控機(jī)制及技術(shù)亦未成熟，因此利用組織工程技術(shù)來(lái)誘導(dǎo)損傷修復(fù)細(xì)胞的遷移成為最近的

2、研究熱點(diǎn)。絲素蛋白由于其具有生物相容性好、易加工成各種形狀、可在生物體內(nèi)緩慢降解、來(lái)源豐富等優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注。目前對(duì)家蠶絲素蛋白的研究已有大量報(bào)導(dǎo)，而柞蠶絲素蛋白的研究還處于起步狀態(tài)，柞蠶絲素蛋白具有獨(dú)特的有利于細(xì)胞粘附的RGD三肽序列，因此柞蠶絲素蛋白極具開(kāi)發(fā)潛力。 為探索神經(jīng)元與絲素蛋白材料結(jié)合的可行性及生物相容性，本研究首先建立了一個(gè)較純的神經(jīng)元培養(yǎng)體系，即從新生大鼠腦室下區(qū)(Subventricular Zone，SVZ)

3、分離細(xì)胞，分別以低密度培養(yǎng)在柞蠶、家蠶兩種絲素蛋白溶液制成的二維薄膜材料以及三維納米纖維材料上，在特定的培養(yǎng)基培養(yǎng)三天后開(kāi)始向神經(jīng)元分化。免疫熒光染色觀察神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育并檢測(cè)其成活率、復(fù)雜度。從成活率分析，神經(jīng)元在柞蠶絲素蛋白二維、三維材料上均比家蠶絲素蛋白材料高，而三維材料上神經(jīng)元的存活率又比二維材料高；從復(fù)雜度分析，神經(jīng)元在柞蠶絲素蛋白二維、三維材料上均比家蠶絲素蛋白材料高，而三維材料上神經(jīng)元的復(fù)雜度又比二維材料高。從而得出結(jié)論：

4、絲素蛋白材料支持神經(jīng)元的生長(zhǎng)，具有良好的生物相容性；柞蠶絲素蛋白材料比家蠶絲素蛋白材料更適合神經(jīng)元的生長(zhǎng)；三維納米纖維材料比二維薄膜材料更適合神經(jīng)元的生長(zhǎng)。 體外分離純化培養(yǎng)的神經(jīng)元缺乏支持細(xì)胞以及各種細(xì)胞因子，且神經(jīng)元沒(méi)有分裂增殖能力，從而存活時(shí)間較短，在本實(shí)驗(yàn)中第五天開(kāi)始出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，因此接下來(lái)本研究進(jìn)行了混合培養(yǎng)系統(tǒng)與絲素蛋白材料結(jié)合的研究，研究在有膠質(zhì)細(xì)胞支持作用下神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育。即從SD新生大鼠大腦皮層分離細(xì)胞，

5、接種在柞蠶、家蠶絲素蛋白來(lái)源的二維薄膜材料以及三維納米纖維材料上，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)六天，底層膠質(zhì)細(xì)胞已基本匯合，上層含有少量的神經(jīng)前體細(xì)胞，此時(shí)換成無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM serum free plus N2 Supplement)后，神經(jīng)前體細(xì)胞大量增殖，最終分化為神經(jīng)元。免疫熒光染色觀察以及BrdlJ摻入法檢測(cè)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與家蠶絲素蛋白相比，柞蠶絲素蛋白有助于細(xì)胞的粘附；與二維材料相比，三維

6、材料有助于細(xì)胞粘附；從BrdU摻入結(jié)果分析，柞蠶絲素蛋白上神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖比例比家蠶絲素蛋白高，而三維材料與二維材料在神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖方面未見(jiàn)明顯差別；然而從細(xì)胞形態(tài)的復(fù)雜程度來(lái)看，柞蠶、家蠶絲素蛋白材料均支持神經(jīng)元的分化，且三維納米纖維材料上神經(jīng)元具有較高的復(fù)雜度，能形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。成熟的神經(jīng)元是分裂后細(xì)胞，不具有DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖功能，迄今為止，體外分離培養(yǎng)神經(jīng)元依然面I臨著許多困難，在一些細(xì)胞量需要大、觀察時(shí)間長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研

7、究中，體外原代培養(yǎng)的神經(jīng)元很難滿足實(shí)驗(yàn)的要求。因此，就需要尋找一種能夠反映神經(jīng)元特性，具有神經(jīng)元表型特征的體外替代細(xì)胞。PC12細(xì)胞是大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤單克隆細(xì)胞株，從發(fā)育學(xué)角度看，嗜鉻細(xì)胞和交感神經(jīng)下細(xì)胞同源，體外培養(yǎng)時(shí)從形態(tài)到功能常表現(xiàn)出神經(jīng)元的本質(zhì)，一般作為神經(jīng)元模型。PC12細(xì)胞內(nèi)含有合成多種神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)鍵酶，因而具有分化為各種神經(jīng)元表型的潛能。實(shí)驗(yàn)將PC12細(xì)胞與絲素蛋白材料相結(jié)合，并以全反式維甲酸(RA)為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)PC12細(xì)胞

8、向神經(jīng)元分化。通過(guò)免疫熒光染色觀察以及對(duì)PC12細(xì)胞誘導(dǎo)分化來(lái)的神經(jīng)元成活率、復(fù)雜度的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：絲素蛋白薄膜和絲素蛋白納米纖維對(duì)PC12細(xì)胞具有良好的生物相容性，能支持PCI2細(xì)胞的存活與生長(zhǎng)；PC12細(xì)胞在絲素蛋白薄膜和絲素蛋白納米纖維上能被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元。并且證實(shí)了PC12細(xì)胞在絲素蛋白材料上誘導(dǎo)分化的過(guò)程中，絲素蛋白材料本身不影響RA對(duì)PC12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。 這些結(jié)果表明絲素蛋白材料可作為神經(jīng)類細(xì)胞生長(zhǎng)的良好生